体外sirna抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的论文

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1、体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的论文【摘要】目的:筛选能高效抑制乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453端粒逆转录酶（htert）基因表达的rna干扰靶点，为乳腺癌的基因治疗提供依据.方法:构建针对htert基因的三种sirna(sirnahtert1,sirnahtert2和sirnahtert3)，分别转导入乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453，同时以无同源性的sirnahtert4作阴性对照，含gfp基因的载体作阳性对照.应用实时聚合酶链反应（realtimepcr）和tt法检测细胞生长率；流式

2、细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响.结果:与阴性对照组相比，sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3三个实验组sirna转染细胞后，htert的mrna表达量下调至21%~40%，蛋白表达下降至50%，而三个实验组间差异无统计学意义（p>0.05）.转染48h后，mcf7细胞抑制率分别为(57±4.3)%，（61±4.3）%，（65±6.0）%；mdamb453细胞抑制率分别为（45±5.1）%，（45±4.1）%，（50±4.0）%.流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡率有所增加，mcf7细

3、胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；mdamb453细胞为(12.25±0.17)%，（17.80±0.19）%，（20.60±0.21）%.结论：经sirnahtert1，sirnahtert2，sirnahtert3处理均可明显抑制mcf7和mdamb453乳腺癌细胞的增殖及htert基因的表达，能够明显促进细胞的凋亡.【关键词】乳腺肿瘤；端粒酶逆转录酶；rna干扰0引言端粒逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase，htert）

4、是端粒酶组成的亚单位，与肿瘤的发生、发展密切相关［1-2］.新近的研究［3-4］表明，应用小片段干扰rna（sirna）沉默或下调htert表达，可降低端粒酶的活性，缩短端粒，从而使肿瘤细胞的生长受到抑制［5-6］.不同sirna转染效率的不同以及靶向htert的不同，sirna对端粒酶活性抑制的程度也有所不同［7］.本研究拟通过设计多对靶向htert基因的sirna，转导入不同的乳腺癌细胞株，筛选出具有特异性下调htert基因表达的sirna，旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.1材料和方法1.1材料乳腺癌mcf7和mdamb453细

5、胞株(上海细胞生物研究所)；lipofectamim2000转染试剂，总rna提取试剂trizol，realtimepcr试剂盒（大连takara公司）；兔抗htert多克隆抗体，辣根酶标记羊抗兔igg（美国sigma公司）；co2孵育箱（hepaclass100,德国thermo公司）；实时荧光定量(realtime)pcr仪（lightcycle，美国roche公司）；流式细胞仪（epicsxl，美国coulterbeckma公司）；蛋白电泳和电转仪（ve186，中国上海天能科技有限公司）.1.2方法1.2.1sirna设计根据

6、htert基因的dna序列（genbankaccessionno.nm_198255.1）设计出互补的3对（sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3）sirna序列［8］，sirnahtert4为无同源性的阴性对照序列.sirna片段由广州锐博生物科技有限公司合成，其序列为：sirnahtert1正义链：5′ggagcagcugcggcccuccdtdt3′,反义链：5′dtdtccucgucgacgccgggagg3′；sirnahtert2正义链：5′aagagggccgagcguc

7、ucadtdt3′,反义链：5′dtdtuucucccggcucgcagagu3′；sirnahtert3正义链：5′ugauuucuuguuggugacadtdt3′,反义链：5′dtdtacuaaagaacaaccacugu3′；sirnahtert4正义链：5′ggcctagctgcgcgagu3′,反义链：5′ggcctcagctgcgcgacga3′.1.2.2sirna转染转染前1d，换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/l，待细胞生长至60%～80%融合时，将sirna脂质体混合物（100μg/

8、5l）转染至细胞中，在37℃，50ml/lco2无血清、无抗素培养液培养16～18h，换新鲜100ml/l胎牛血清培养基，继续培养2～5d后检测各指标.实验分为空白对照组（不含转染试剂和sir