sirna特异性抑制骨肉瘤细胞株her2基因的表达

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1、siRNA特异性抑制骨肉瘤细胞株HER2基因的表达作者：王玉峰，王岩峰，祝勇，邴佩旭【摘要】［目的］观察RNA干扰技术对骨肉瘤细胞株（OS732细胞）HER2（表皮生长因子受体2）表达的抑制效应。［方法］体外化学合成HER2序列特异性双链RNA（siRNA），转染入OS732骨肉瘤细胞株中，分别用RTPCR、TT（四甲基偶氮唑盐比色法）检测细胞的增殖和化疗敏感性，观察细胞生物学特性的改变。［结果］HER2siRNA对OS732细胞HER2mRNA表达明显抑制，作用约持续10d；干涉第9d，干涉组细胞

2、蛋白表达减弱；细胞对顺铂的敏感性提高约10倍。［结论］体外合成的siRNA能有效抑制骨肉瘤OS732细胞中HER2基因的表达，抑制细胞的增殖，并提高了细胞对顺铂的敏感性。【关键词】RNA干扰；siRNA；骨肉瘤；HER2Abstract：［Objective］ToinvestigateicallysynthesizeddoublestrandedRNA（dsRNA）formulatedine2000.TheHER2geneexpressioninhibitionmunocytochemistry.Thechem

3、osensitivityoftransfectedcellstocisplatininedbyMTTmeasurement.［Result］SequencespecificsiRNAstargetingHER2doorlinesinvitrogreatlyreducedtheexpressionoftheHER2mRNA,effectslastedfor10days,Onthe9thdayofinterference,HER2protEinexpressionodalitiesinthetreatmentofhu

4、manosteosara.KeyRNA等外源基因的侵害，高效特异的阻断基因的表达是RNAi的一大特征，对该技术的研究已成为肿瘤治疗的重要方向〔1〕。癌基因产物HER2是表皮细胞生长因子受体（EGFR）家族中的重要成员。HER2在人类恶性肿瘤中的高表达，被证明与肿瘤的侵袭性相关，抑制该受体功能是肿瘤治疗的重要方向。本文通过采用RNAi技术抑制人骨肉瘤细胞HER2的表达，从而为骨肉瘤的基因治疗提供新策略。1材料和方法1.1材料人骨肉瘤OS732细胞株购自北京积水潭医院骨科研究所，HER2单抗购自北京中山公司，Re

5、versetranscriptionsystem，Trizol，dNTP购自大连宝生公司，TaqDNA聚合酶购自Takara公司。HER2引物序列为：F5′CCTGCTGAACTGGTGTATGCA3′，R5′TCAGAGTAATCATCAAATTG3′，由Takara公司合成，预扩增片断产物为429bp。以βactin作内对照，引物序列为；F5′GATTGCCTCAGGACATTTCTG3′，R5′GATTGCTCAGGACATTTCTG3′；扩增产物长为690bp。1.2方法1.2.1siRNA合成根据HER

6、2基因在GenBank中的序列设计相应的siRNA：从启动子下游75碱基处找到第1个AA二聚体，记录AA下游19个碱基序列为目的序列，计算目的序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比（G／C）〔2〕。应用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的惟一性。人工合成针对26442664nt位碱基靶序列的2条寡核苷酸链。siRNAF5′CUGGUGUAUGCAGAUUGCCUU3′，siRNAR5′GGCAAUCUGCAUACACCAGUU3′。序列非特异性siRNA：siRNAF5′CUUGUAUGGGCAAUGCUU3

7、′，siRNAR5′-GGCAAUCUGCCCAUACAAGUU3′。1.2.2细胞培养及转染骨肉瘤细胞分组：A组为空白对照（未转染）；B组转染非特异性的siRNA；C组转染特异性的siRNA。转染前24h，取对数生长期的细胞胰酶消化，计数，调整细胞浓度为1×105／ml，接种，孵箱培养36h，待细胞培养达80％融合。转染：（1）配制液体，A液：7.5μlsiRNA+250μlMcCoy5A培养基；B液，10μlLipofectamine+250μlMcCoy5A培养基，吹匀，室温5min。（2）A液与B液混合，

8、吹匀，室温放置20min。（3）将混合液加入6孔培养板中培养6h，对照组只加10μlLipofectamine+250μlMcCoy5A培养基。（4）6h后，换液，置培养基中培养48h。1.2.3RTPCR法检测HER2mRNA首先进行培养细胞总RNA抽提，取5μlRNA水溶液在琼脂糖凝胶电泳上检测RNA质量，用紫外分光光度