体外sirna抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达

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1、体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达作者：杨明峰，刘安定，郑专，陈建军，董学君【摘要】目的:筛选能高效抑制乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB453端粒逆转录酶（hTERT）基因表达的RNA干扰靶点，为乳腺癌的基因治疗提供依据.方法:构建针对hTERT基因的三种siRNA(siRNAhTERT1,siRNAhTERT2和siRNAhTERT3)，分别转导入乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB453，同时以无同源性的siRNAhTERT4作阴性对照，含GFP基因的载体作阳

2、性对照.应用实时聚合酶链反应（realtimePCR）和TT法检测细胞生长率；流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响.结果:与阴性对照组相比，siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3三个实验组siRNA转染细胞后，hTERT的mRNA表达量下调至21%~40%，蛋白表达下降至50%，而三个实验组间差异无统计学意义（P>0.05）.转染48h后，MCF7细胞抑制率分别为(57±4.3)%，（61±4.3）%，（65±6.0）%；MDAMB453细胞抑

3、制率分别为（45±5.1）%，（45±4.1）%，（50±4.0）%.流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡率有所增加，MCF7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；MDAMB453细胞为(12.25±0.17)%，（17.80±0.19）%，（20.60±0.21）%.结论：经siRNAhTERT1，siRNAhTERT2，siRNAhTERT3处理均可明显抑制MCF7和MDAMB453乳腺癌细胞的增殖及hTERT基因的表达，能够明

4、显促进细胞的凋亡.【关键词】乳腺肿瘤；端粒酶逆转录酶；RNA干扰0引言端粒逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）是端粒酶组成的亚单位，与肿瘤的发生、发展密切相关［1-2］.新近的研究［3-4］表明，应用小片段干扰RNA（siRNA）沉默或下调hTERT表达，可降低端粒酶的活性，缩短端粒，从而使肿瘤细胞的生长受到抑制［5-6］.不同siRNA转染效率的不同以及靶向hTERT的不同，siRNA对端粒酶活性抑制的程度也有所不同［7］.本研究拟通过设

5、计多对靶向hTERT基因的siRNA，转导入不同的乳腺癌细胞株，筛选出具有特异性下调hTERT基因表达的siRNA，旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.1材料和方法1.1材料乳腺癌MCF7和MDAMB453细胞株(上海细胞生物研究所)；LipofectamineTM2000转染试剂，总RNA提取试剂Trizol，realtimePCR试剂盒（大连TakaRa公司）；兔抗hTERT多克隆抗体，辣根酶标记羊抗兔IgG（美国Sigma公司）；CO2孵育箱（HEPACLASS100,德国Thermo公

6、司）；实时荧光定量(realtime)PCR仪（LightCycle，美国Roche公司）；流式细胞仪（EPICSXL，美国CoulterBeckma公司）；蛋白电泳和电转仪（VE186，中国上海天能科技有限公司）.1.2方法1.2.1siRNA设计根据hTERT基因的DNA序列（GenBankaccessionNO.NM_198255.1）设计出互补的3对（siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3）siRNA序列［8］，siRNAhTERT4为无同源性的

7、阴性对照序列.siRNA片段由广州锐博生物科技有限公司合成，其序列为：siRNAhTERT1正义链：5′GGAGCAGCUGCGGCCCUCCdTdT3′,反义链：5′dTdTCCUCGUCGACGCCGGGAGG3′；siRNAhTERT2正义链：5′AAGAGGGCCGAGCGUCUCAdTdT3′,反义链：5′dTdTUUCUCCCGGCUCGCAGAGU3′；siRNAhTERT3正义链：5′UGAUUUCUUGUUGGUGACAdTdT3′,反义链：5′dTd

8、TACUAAAGAACAACCACUGU3′；siRNAhTERT4正义链：5′GGCCTAGCTGCGCGAGU3′,反义链：5′GGCCTCAGCTGCGCGACGA3′.1.2.2siRNA转染转染前1d，换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/L，待细胞生长至60%～80%融合时，将siRNA脂质体混合物（100μg/5L）转染至细胞中，在37℃，50mL/LCO2无血清、无抗素培养液培养16～18h，换新鲜100mL/L胎牛血清培养基，继续培养2～5d后检测