sirna抑制skov3细胞her2-neu表达及细胞增殖的动物实验研究

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1、siRNA抑制SKOV3细胞Her2/neu表达及细胞增殖的动物实验研究：程志祥,周颖,朱园园,肖敏,高宗侠,祝怀平,凌斌【摘要】　　目的:通过卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖及动物荷瘤实验探讨siRNA沉默Her2/neu基因的表达效果。方法:靶向Her2/neu的siRNA经脂质体LipofectAMINE2000介导转染到SKOV3中,通过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her2/neu基因表达的SKOV3/siRNA细胞株,通过RTPCR和免疫组化方法检测Her2/neu基因抑制效果,运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组细胞增殖水平并将SKOV3/siRNA细胞接种到裸鼠皮下检测荷瘤

2、情况。结果:建立了稳定抑制Her2/neu基因表达的细胞株SKOV3/siRNA,RTPCR和免疫组化结果显示Her2/neu基因表达受到较强抑制,MTT检测结果显示SKOV3/siRNA组细胞增殖较SKOV3明显下调（P<0.05）,其接种在裸鼠皮下形成的肿瘤生长速度明显减慢（P<0.05）。结论:靶向Her2/neu基因的siRNA可以抑制卵巢癌细胞株SKOV3在体外和体内增殖,有望成为卵巢肿瘤治疗的新途径。【关键词】Her2/neu基因RNA干扰卵巢肿瘤　　Her2/neu基因是人类肿瘤中常发生异常改变的基因之一,定位于人类染色体17q21,编码Mr为185000的

3、蛋白,命名为p185[1]。Her2/neu（p185）受体属于受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase,RTK）超家族,其过度表达可以赋予卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞更高的恶性生物学行为,且与肿瘤的化疗敏感性及预后呈明显的负相关[2]。RNA干扰(RNAInterference,RNAi)是指在生物体细胞内,外源性或内源性的双链RNA引起与其同源mRNA的特异性降解,因而抑制其相应基因表达的过程。本研究中利用RNAi技术,用脂质体将靶向Her2/neu基因的siRNA转染入卵巢癌细胞株SKOV3,建立了稳定抑制Her2表达的SKOV3/siRNA细胞株,并探讨其体外增殖特

4、性及在动物体内的成瘤力,以期为逆转肿瘤细胞恶性生物学行为的研究提供动物实验基础。　　1材料和方法　　1.1材料SKOV3细胞株购自上海细胞所,McCoy’s5A改良培养基、胎牛血清为Gibco公司产品（SKOV3细胞在37℃50mL/LCO2饱和湿度下培养）;BALB/c系雌性裸小鼠(14只,8周龄,质量20～25g),购自上海实验动物中心;脂质体LipofectAMINE2000、总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒购自Promega公司;TaqDNA聚合酶购自华美生物工程有限公司;siRNA载体、上、下游引物由上海生工合成;免疫组化试剂盒SAP9102

5、和Her2/neu小鼠抗人单克隆抗体（mAb）购自北京中杉金桥生物技术有限公司;四甲基偶氮唑蓝（MTT）为Sigma公司产品。　　1.2方法　　1.2.1人卵巢癌细胞株SKOV3细胞培养与siRNA转染对数生长期SKOV3细胞按1×105/孔移至6孔板以含100mL/L胎牛血清的McCoy’s5A改良培养液培养。实验对照组不转染siRNA,转染试验组转染siRNA质粒。细胞80%融合时进行转染。转染按照LipofectAMINE2000说明书进行,4h后更换完全培养液,48h后更换含嘌呤霉素的完全培养液筛选培养,每3～4d换液,约20d后筛选成活并完全汇合的细胞,传代培养。转染组细胞株命名

6、为SKOV3/siRNA。　　1.2.2RTPCR检测Her2/neu基因mRNA的表达提取各组SKOV3细胞的总RNA,按逆转录试剂盒说明逆转录成cDNA,逆转录体系25μL。随后行PCR反应,以βactin为内参,Her2/neu上下游引物为5′TGCGGCTCGTACACAGGGACTT3′和5′TGCGGGAGAATTCAGACACCAACT3′,反应体系为25μL,产物大小420bp,βactin大小500bp。10g/LTAE琼脂糖凝胶电泳检测。　　1.2.3免疫组化检测p185蛋白的表达将细胞分别接种在置有无菌处理过盖玻片的6孔板中,细胞融合80%时收获细胞爬片

7、,采用免疫组化检测p185蛋白的表达,通过SAP9102试剂盒检测,Her2/neumAb稀释度为1∶100,DAB显色,细胞质或膜出现棕褐色为阳性染色,阴性对照片用PBS代替Her2/neumAb。免疫组化半定量分析采用病理科医学彩色图像分析系统（ImageProPlus）:在光镜(×400)下随机选取40个染色较好的视野,细胞染色阳性部位的颜色深浅及范围以平均积分光密度值（IOD）表示,该值越