微生物来源的次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶抑制剂2264 a和b的研究论文

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1、微生物来源的次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶抑制剂2264A和B的研究论文林洁可爱兵张雪莲郑智慧朱京童路新华*李业英崔晓兰石英张华贺建功【摘要】利用自建的快速高效的次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶(Inosinemonophosphatedehydrogenase，IMPDH)抑制剂的高通量筛选模型，筛选分离得到两个活性化合物2264A和B，通过对其紫外、质谱、核磁等理化数据的分析确定2264A为cyclopenol，2264B为viridicatol。2264A和B对IMPDH的IC50分别为69.68、11.86μmol/L；体外脾淋巴细胞增

2、殖实验显示2264A和B分别在322.6和65.8μmol/L浓度下可完全抑制由ConA活化的脾淋巴细胞增殖，表明2264B在分子水平和细胞水平均表现出较好的免疫抑制活性，2264A的活性相对较弱。【关键词】次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶；免疫抑制剂；Cyclopenol；ViridicatolABSTRACTInosinemonophosphatedehydrogenase(IMPDH)isanessentialratelimitingenzymeinthepurinemetabolicpathphocyteproliferati

3、on.IMPDHhasthereforebeenanattractivetargetfordevelopingimmunosuppressivedrugs.Thisinvestigationmetabolitesofmicroorganism,andticalproperties,MS,13CNMRand1HNMRanalysis.IC50of2264AandBol/Land11.86μmol/LtoIMPDH,respectively,andtheycouldpletelyinhibitthespleenlymphocy

4、tesproliferationstimulatedbyConAat322.6μmol/Land65.8μmol/Linvitro.2264AandBshooderateinhibitoryactivitytoIMPDHandspleenlymphocytesproliferation.KEYPDH)是鸟嘌呤核苷酸经典合成途径的限速酶，IMPDH受抑制将导致鸟嘌呤核苷酸缺乏，DNA合成受阻，使细胞静止于G1期，因此其活性与细胞增殖紧密联系。这种酶的抑制剂被发现具有抑制免疫力的作用［3，4］，因此IMPDH成为免疫相关疾病药物的

5、重要靶点。为了研究和发现更加有效和低毒的免疫抑制药物先导化合物，本研究利用以IMPDH为靶点的高通量筛选模型从微生物的代谢产物中进行药物筛选，并从阳性菌株2264的发酵产物中分离得到活性化合物2264A和B。本文报道了2264A和B的筛选、发酵、分离纯化、结构鉴定及其生物学免疫活性。1材料与方法1.1筛选用微生物的菌株真菌菌株2264由本室从5000株真菌中筛选得到。1.2试剂及仪器人类II型IMPDH表达质粒由本实验室构建；E.coliDH5α由本实验室保存；NADH、NAD和IMP(Sigma公司)；BABL/C小鼠，雌性

6、，6周龄(河北医科大学实验动物厂)；RPMI1640(GIBCO公司)；十二烷基硫酸钠(LaurylSulfateSodium，SDS)(GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青)；噻唑蓝(ThiazolylBlue，MTT)(Sigma公司)；青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)；其余化学试剂均为分析纯或色谱纯试剂。Victor21420多标计数仪(美国PE)；中压层析系统(瑞士BUCHI)；高压液相(美国DMicromass质谱仪(ESIMS，美国Hz核磁共振仪(Varian)；96孔培养板(美国Corning)。1

7、.3IMPDH抑制剂活性测定原理及方法活性测定原理以NAD和IMP为底物，NADH为显色剂，在96孔板上测定样品对IMPDH抑制剂活性。反应式为：活性测定方法在96孔板上，样品孔中加入2μl待测样品、20μl酶提取液和30μlIMP；对照孔中加入2μlDMSO，30μlIMP；空白孔中加入2μlDMSO和20μlIMPDH缓冲液代替酶提取液和30μlIMP。37℃保温15min，测定孔A340(OD1)，然后每孔中加入50μlNAD，37℃保温50min，测定每孔A340(OD2)。样品对IMPDH抑制率的计算公式为：抑制率(

8、%)=对照(OD2-OD1)-样品(OD2-OD1)对照(OD2-OD1)-空白(OD2-OD1)×100%1.4对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用［5］按常规方法制备脾淋巴细胞悬液，用含10%新生牛血清的RPIM1640培养液重悬，调整细胞浓度至1×107个/ml，加