微生物来源的醛糖还原酶抑制剂n99-253b的分析研究

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1、中文摘要微生物来源的醛糖还原酶抑制剂N99—253B的分析研究摘要醛糖还原酶(AR)广泛存在于哺乳动物组织中，是聚醇通路中的一个关键酶，可催化葡萄糖转化为山梨醇，与白内障、神经系统障碍、肾病变等糖尿病并发症有密切关系。大量的动物和临床试验证明，醛糖还原酶抑制剂(A尉)从病因上提供了糖尿病并发症的治疗方法。f自然界微生物资源十分丰富，据有关统计，全球微生物约有lO亿种，现已被人们认识的仅占1％。尤其我国地域辽阔，自然条件复杂，微生物菌种资源为世界所注目。而且，微生物本身代谢产物具有多样性，某一个菌的代谢产物就可达数十或数百乖弦比合成得

2、到的化学物质要新颖且成本低廉。因此厂)得天独厚的微生物资源为醛糖还原酶抑制剂的筛选提供了有利的物质来源。高通量筛选(Hi曲throughputscreening，简称Hts)技术是近年来伴随着生物化学的发展而形成的一种新型的创新药物研究技术。／所谓高通量筛选是指那些根据人体内某些特定的代谢过程为靶点而设计的特异性强、高效快速的筛选模型乞，利用高通量筛选模型对微生物来源的天然化合物库进行筛选，开发成新药已有不少成功的实例。现在已上市的ARI的毒副作用较大，因此很有必要寻找新的低毒高效的ARI。本文具体阐述了微生物来源的醛糖还原酶抑制剂

3、N99．253B的高通量筛选、分离纯化和中文摘要检测尤其是高效液相分析方法。厂f第一部分醛糖还原酶抑制剂N99-253B的筛选、＼制备和结构确定1．研究目的：建立微生物来源的醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选方法，经筛选找到有抑制活性的发酵液，将该菌株成功保藏和培养，从发酵液中分离纯化获得高纯度活性化合物并确定其结构。2．方法：2．1高通量筛选方法用硫酸铵分级沉淀的方法从猪晶状体中提取醛糖还原酶。筛选模型采用DL．甘油醛作底物，在辅酶NADPH的存在下，醛糖还原酶催化DL一甘油醛还原为甘油，同时NADPH转化为NADP+，NADPH的吡啶

4、环在340nm处有特征吸收，通过测定酶促反应体系340nm处光密度的下降速率，间接测定醛糖还原酶的活性。实验观测温度、NADPH浓度、DL．甘油醛浓度、酶浓度对反应体系的影响，确定最佳值后，用96孑L板测定。样品孔加入：60mmol／LNaPi缓冲液(pH6．2)和适量的酶液共90DI，10¨1样品的甲醇溶液；对照孔加入：60mmol／LNaPi缓冲液(pH6．2)和适量的酶液共90“1，10pl甲醇；空白SUJU入：60mmol／LNaPi缓冲液(pH6．2)909l，10pl甲醇。均在37。C保温15分钟，各孔加入66．6“1l

5、，2mol／LLi，S吼、16．7pl36mmo]／LDL一甘油醛和16．7p]2中文摘要1．5mm01／LNADPH开始反应，用Wallac1420多酶标记数仪于340nm波长处测定37℃每分钟的光密度减少值(AOD／min)。样品抑制率7--．AOD／min(对照I_{AOD／min(样品jA0D／min(对照)l_{AOD／min(空白}2．2微生物来源的AR]的筛选从新疆、云南土壤中分离得到的放线菌N98．1～2141和N99．1．500，经斜面转移、46号和48号两种培养基发酵，得到5282种发酵液。每种发酵液加等体积的乙

6、醇浸泡，离心，取上清蒸干乙醇，用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物作为筛选用样品。2．3微生物来源的ARI筛选通过样的纯化将有抑制活性的菌种长期保藏并大规模培养，然后对其发酵液进行乙酸乙酯提取、薄层层析、硅胶柱层析和制备型HPLC分离纯化，获得具有抑制活性的高纯度化合物。2．4活性化合物结构的确定将获得的高纯度活性化合物进行紫外光谱测定、质谱测定、核磁共振测定，通过解析图谱和文献检索确定其化学结构。3．结果：3．1从猪晶状体中提取的醛糖还原酶在确定的反应条件下，在酶量为0．0mg-1．0mg的范围内，酶量与酶活性之间3中文摘要呈现出非常好

7、的线性关系(r=0．9984)，该酶完全可用作靶酶进行筛选。3．2通过筛选2641个株菌的5282种发酵液，发现N99-253(46)号发酵液具有抑制活性，抑制率>80％，通过率是0．019％．3．3N99—253(46)的分离纯化N99—253(46)发酵液的上清(8)和菌体(M)分别用乙酸乙酯提取，对乙酸乙酯提取物进行TLC检测，硅胶为60F删，展层剂为氯仿：甲醇=10：2(v：v)。结果发现N99—2538和N99—253M的组分分布情况基本相同，合并二者，浓干得1．55克(N99—253)。用紫外光254nm显影检测共得11

8、条带，进行对醛糖还原酶的抑制活性检测，发现第五带(Rf值=O．32)有抑制活性且活性大于75％。N99—253乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析，对收集到的各组份进行活性测定，活性组份在氯仿：甲醇为93：7～90：10(v／v)时被洗脱，收活