微生物来源的xa因子抑制剂f022172的研究论文

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1、微生物来源的Xa因子抑制剂F022172的研究论文路新华郑智慧马瑛石英董悦生任晓穆栋张华贺建功【摘要】利用一种由本中心建立的Xa因子抑制剂高通量体外筛选模型，从大量真菌菌库及其来源的代谢产物中筛选到了一株可产生阳性活性化合物的菌株F02ZA2172，该菌株的发酵液经有机溶剂提取、硅胶柱色谱、ODS柱色谱、SephadexLH20柱色谱及HPLC制备分离，得到F022172A、B和C三个活性化合物。经紫外、质谱、核磁等理化数据分析，确定这三个化合物分别与已知化合物6epiophiobolinK、ophiobolinK和ophiobolinG的结构相同，

2、但该类化合物对Xa因子的抑制活性至今未见报道。【关键词】微生物Xa因子抑制剂二倍半萜F022172,factorXainhibitorsfrommetabolitesofmicroorganismsABSTRACTAhighthroughputscreeningmodelthousandsofstrainsoffungi,asaresult,astrain,F02ZA2172nchromatography,SephadexLH20columnchromatographyandODSHPLCpreparationtoobtainthreepureactive

3、poundsnamedF022172A,BandC.Theirchemicalstructuresed6epiophiobolinK,ophiobolinKandophiobolinGbyphysicochemicalpropertiesandspectraldataofUV,MS,1HNMRand13CNMRrespectively.ThepoundsarereportedasfactorXainhibitorsforthefirsttime.KEYicroorganisms;FactorXainhibitor;Sesterterpenes血栓的形成

4、是心血管疾病(如心肌梗死、中风、深度静脉血栓、肺栓塞等)重要致病因素，抗血栓治疗一直是这类疾病抢救措施及预防策略的核心，其中抗凝血是抗血栓治疗的重要方法之一.freel，商品名：方达帕鲁)于2001年12月在美国获得FDA批准［3］］或正在开发中［4］。本实验室建立了一个快速的高通量筛选方法，从大量土壤真菌代谢产物中筛选Xa因子抑制剂，筛选得到阳性菌株F022172。本文报道其发酵、分离、结构鉴定和生物学活性。1材料与方法1.1筛选用微生物的菌株真菌菌株由本中心从云南和新疆采集的土壤中分离得到。1.2试剂及仪器Xa因子和底物MCA(BocIleGluGl

5、yArg7amido4methylcoumarinhydrochloride)购自美国Sigma公司；色谱乙腈购自Merck公司；Victor2多标计数仪(美国PE公司)；中压层析系统(德国BUCHI公司)；高效液相系统(美国Hz(Inova)；质谱仪(AutospecUltima)。1.3Xa因子活性测定方法活性测定方法由本中心建立，原理是Xa因子可以水解特定的荧光标记多肽底物，通过荧光值的变化计算抑制剂对酶的抑制活性。活性测定反应在96孔板进行，样品孔中加入0.1mol/LTris(pH8.0，10mmol/LNaCl，10mmol/LCaCl2

6、)、适量的酶液(Xa因子)和样品的DMSO溶液；对照孔以DMSO代替样品溶液；空白管以DMSO代替样品溶液并以Tris缓冲液代替酶液，在37℃保温15min，测定荧光F1(Ex355nm/Em460nm)；各孔加入底物，37℃保温1h，测荧光F2。其中，抑制率大于80%的样品为阳性。样品抑制率(%)=［F2-F1］(对照)-［F2-F1］(样品)［F2-F1］(对照)-［F2-F1］(空白)×100%1.4真菌F022172的培养将菌株F02ZA2172斜面接种于种子培养基(淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%，酵母0.5%，CaCO30.

7、2%，MgSO4·7H2O0.1%，NaCl0.2%，pH7.0)，27℃，220r/min摇瓶培养3d。按1%接种的量接种到固体培养基(大米97.5%，黄豆饼粉2.5%)27℃培养14d。1.5F02ZA2172的提取分离F02ZA2172固体培养物2kg，用2000ml乙酸乙酯萃取，减压蒸去溶剂得到深褐色油状物3.5g。上述粗提物经硅胶柱(2.6cm×50cm)色谱，正己烷乙酸乙酯梯度洗脱，每50ml收集一管，合并活性组分，减压蒸干。活性物质部分用ODS反相中压柱色谱(MerckODSC18，40μm，1.6mm×50mm)进一步分离纯化，然后用制备型

8、HPLC进行单组分的制备