微生物来源结核分枝杆菌蛋白激酶b抑制剂筛选模型的建立和应用

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1、硕士学位论文论文题目微生物来源结核分枝杆菌蛋白激酶B抑制剂筛选模型的建立和应用所院：姓名：指导教师：学科专业：研究方向：完成日期：医药生物技术研究所邢韵余利岩教授微生物与生化药学抗感染药物研究20146独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：jP祗签字日期：加降年6月7日学位论文版权使用授权

2、书本学位论文作者完全了解j匕塞迹塑医堂陵有关保存、使用学位论文的管理办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权j＆赴狸医堂瞳可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：毒≯私签字日期：冽4年‘月7日导师签名：原游)声．签字日期：加件年6月7日学位论文作者毕业后去唾厂，东角彩k远专工作单位：丽确岖为僳坷诹螵^司‘电话：仞哟孵方通讯地址：广柚砾啦千厩讯匡南泵圄穹萜邮编奠7妙∞目录微生物来源结核分枝

3、杆菌蛋白激酶B抑制剂筛选模型的建立和应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯0缩略语表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3Abs仃act⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4微生物来源结核分枝杆菌蛋白激酶B抑制剂筛选模型的建立和应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5日U吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯)实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．16一、基于NADH比色法以PkI也为靶点的高通量筛选模型的建立和优化⋯16l重组质粒pET28a．p砌B—Ⅳ、pET30a-卯捌在大肠杆菌中的诱导表达⋯⋯．．162目的蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯203结核分枝杆菌重组蛋白P舳-N酶活性检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．224结核分枝杆菌重组蛋白PhlB_N酶活测定体系的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．235待测样品对PhlB．N抑制作用的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯．256假阳性结果的排除⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26二、结核分枝杆菌P舳抑制剂细胞水平的性质评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．261微稀释法检测酶水平阳性样品的抗菌活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262MTT比色法检测阳性发酵液样品对细胞存活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27三、阳性发酵液样品体外酶活抑制选择性评价体系的建立及应用⋯⋯⋯⋯．28l阳性发酵液样品对结核分枝杆菌肽脱甲酰基酶(PDF)酶活抑制性评价‘241．．282结核分枝杆菌蛋白激酶H、蛋白激酶F、人蛋白激酶—U汀．1的诱导表达293基于NADH比色法的结核分枝杆菌重组蛋白Pkrm、P

6、knF和人的重组蛋白AKT．1酶活性检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．35四、阳性菌株次级代谢产物的初步处理及活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38l五株阳性菌株110A．00359、110A．00827、11lA．01925、111A．02040、111A．02296的发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一382五株阳性菌株发酵产物的初步处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38实验结果及讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一40一、基于NADH比色法以Pl(11B为靶点的高通量筛选模型的建立和优化⋯4

7、01结核分枝杆菌重组PlmB-N、G以的表达与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402结核分枝杆菌重组PkllB．N酶活性检测体系的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．413发酵液样品酶水平的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46二、复筛阳性发酵液样品细胞水平的活性和毒性评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．471复筛阳性发酵液样品的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯472复筛阳性发酵液样品抗菌活性评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473复筛阳性发酵液样品细胞毒性评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48三、阳性发酵液样品体外酶活抑制选择性评价体系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．481

8、pET28叩砌日、pET28a节砌F、pET28a．