dppiv抑制剂筛选模型的优化与应用

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文DPPIV抑制剂筛选模型的优化与应用TheoptimizationandtheapplicationfortheselectionofDPPIVinhibitor课题来源：自选专业名学位申请指导教称药理学人江慧贤师庞建新教授答辩委员会主席答辩委员会成员刘培庆教授雷林生教授张嘉杰教授朱邦豪教授蔡铮副教授论文评阅人李琳教授符立梧教授2012年5月29日广州硕士学位论文DPPIV抑制剂筛选模型的优化硕士研究生：江慧贤指导老师：庞建新教授摘要研究背景和目的糖尿病(diabetesmellitus，DM)t虫多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱

2、，伴有因胰岛素分泌和／或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常。该病在临床上的主要病征为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体重减轻。近年来，随着我国社会经济条件的改善，人民生活水平的不断提高，饮食结构的改变，劳动强度的减低，糖尿病患病率在逐渐上升，糖尿病对我国人民健康的影响吕趋严重，2009年卫生部与世界糖尿病基金会联合主办的“糖尿病国际论坛’’上，与会各方指出，中国糖尿病患者仅次于印度，是世界第二位糖尿病患者的人数已居世界第二位，增长速度惊人。II型糖尿病是一种胰岛素抵抗伴13细胞分泌胰岛素不足而导致的，是由基因和环境因素相互影响引起的复杂、多基因性慢性高血糖疾病。据估计

3、，II型糖尿病的遗传率达70％．80％。遗传因素在II型糖尿病中起主要的发病机理。而且，不同种群的发病率不尽相同，从白种入的5％到亚洲入的50％。II型糖尿病多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌；治疗的短期目标是控制血糖，长期目标是预防相关并发症的发生与发展。其基础治疗方案主要由运动和饮食构成，但是药物治疗和血糖监测往往也非常关键。摘要常规治疗II型糖尿病13服药大致分为磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类(胰岛素增敏剂)、Gt．葡萄糖苷酶抑制剂和非磺脲类胰岛素促泌剂。近年来，随着分子生物学的进展，对于糖尿病的发病机制有更深一

4、步的了解，并根据不同的发病机制研发出不同作用机理的新型抗糖尿病药，为临床治疗糖尿病提供多种途径，二肽基肽酶IV(DipeptidylPeptidaseIV，DPPIV)抑制剂就是其中的一种。二肽基肽酶．IV／CD26(DPPIV／CD26；EC3．4．14．5)属于脯氨酰寡肽酶家族中的丝氨酸蛋白酶，当氮末端第二位为脯氨酸或者丙氨酸时，DPPIV可以在该部位劈开蛋白或多肽。20世纪以来，随着肠促胰岛素(incretin)概念的提出和研究的深入，该领域的研究越来越受到人们的重视；因其具有保护和促进胰岛夕细胞增殖，促进胰岛素分泌同时抑制胰高血糖素分泌等作用而备受研究者青睐。但肠促

5、胰岛素主要成分胰高血糖素样肽一1(glucagon-likepeptide-l，GLP—1)和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(glucose—dependentinsulinotropicpeptide，GIP)在体内易受DPPIV降解而半衰期很短暂，无法起到生理活性作用。对DPPIV抑制剂的研究成为糖尿病治疗研究的一个新热点，并且取得了显著的成效，以磷酸西他列汀(sitagliptinphosphate，Januvia)为代表的不同类型的小分子DPPIV抑制剂不断涌现，成为极具前景的II型糖尿病新治疗策略。目前，国外对DPPIV抑制剂的研究较为深入，主要通过Caco．2细胞或动物

6、肝肾组织细胞提取液获取DPPIV，与特异性底物甘氨酰一脯氨酰．对硝基苯胺(Gly．Pro．pNA)反应的方式来构建抑制剂筛选模型，而国内对DPPIV抑制剂体外筛选模型的研究匮乏。本研究旨在建立一个简便，快捷，高效的DPPIV抑制剂的体外筛选模型，并通过模型快速寻找该类抑制药物。本实验建立的筛选模型是对本实验室已有的DPPIV抑制剂筛选模型的细胞破碎液、底物浓度、pH，孵育时间三个条件进行优化。实验采用L9(34)正交实验，以酶比活力做判断的指标，考察以上三个条件对模型的影响，以期达II硕士学位论文到减少能耗、更快捷地进行抑制剂的筛选，为以后对批量化合物的DPPIV抑制活性进

7、行高通量筛选提供依据。以高浓度的sitagliptin为阳性对照，纯水代替sitagliptin为阴性对照测定Z’因子、信噪比S／N，评价筛选模型的优劣；设置液氮、．20"C、4"C、25℃、37℃作为放置温度分别保存不同时间，检测细胞破碎液中DPPIV的活性；从1％．30％梯度设置7个体积浓度的DMSO、乙醇、乙酸乙酯，考查常用的有机溶媒对DPPIV活性的影响；利用实验测出的DPPIV动力学参数Km，Vmx的判断化合物巾．1，巾．2抑制的性质；使用本筛选模型筛选一系列合成的化合物对DPPIV抑制的活性。方法1．C