过表达大鼠ace细胞模型建立和ace抑制剂筛选模型的研究

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1、NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeEstablishmentofcellmodelover-expressionratACEandstudyonpreliminaryscreeningofACEinhibitorsStudent’sName:MaLinSupervisor：TanHuanranSubjectCategory:MedicalscienceMajor:PharmacologySpecialty:MoleculepharmacologySchool:SchoolofB

2、asicMedicalScienceCompletionDate:Mar.2011宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国

3、家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要过表达大鼠ACE细胞模型的建立与ACE抑制剂筛选模型的研究中文摘要目的构建pEGFP-ACE真核表达载体，并利用HepG2细胞建立过表达大鼠血管紧张素转化酶I（AngiotensinIConvertingEnzy

4、me，ACE）的细胞模型，为血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotensin-convertingenzymeinhibitors，ACEI）类药物的筛选提供研究工具。方法①pEGFP-ACE真核表达载体的构建及鉴定：Trizol法提取大鼠肺组织总RNA，利用RT-PCR（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）的方法得到ACEcDNA，回收纯化目的基因，并与质粒pEGFP-C1经SalI和Acc65I双酶切的产物在T4DNA连接酶的作用下连接，转化至感受态大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素（30μg/ml）的LB琼脂

5、平板上培养过夜，挑取和筛选阳性克隆。酶切鉴定后的阳性克隆进行测序，用BLAST软件与GeneBank数据库进行同源性分析。②HepG2细胞的转染和重组大鼠ACE蛋白的表达及检测：提取的重组质粒pEGFP-ACE，在250V，20ms的条件下电转染HepG2细胞。在转染48h后收集细胞，Westernblot鉴定重组ACE蛋白的表达情况；利用pEGFP载体的G418抗性，筛选出过表达ACE的细胞株。③ACE活性的测定：利用马尿酰-组氨酰-亮氨酸（hippuryl–L–histidyl-L-leucine，HHL)可在ACE的催化下迅速分解产生马尿酸(hippuri

6、cacid，HA)，以高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)测定反应液中的马尿酸生成量来检测ACE的活性；利用血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotensin-convertingenzymeinhibitors，ACEI）类药物—卡托普利（captopril）对ACE活性的抑制作用对所得细胞株进行检测。结果①利用RT-PCR法成功获得大鼠ACEcDNA，重组真核表达载体经EcoRI酶切鉴定、测序及BLAST分析证实得到正确的重组pEGFP-ACE质粒。②电转染HepG2细胞48h后，Westernbl

7、ot鉴定重组ACE蛋白在HepG2细胞中的表达，在约180KD处出现条带，并筛选得到稳定表达ACE的细胞株。③利用HPLC法证实过表达ACE的细胞株对HHL的催化分解作用与HepG2细胞相比有显著差异；利用卡托普利对ACE活性的抑制作用，检测结果显示卡托普利对过表达I宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要ACE细胞株具有特异性抑制作用。结论本实验成功构建了大鼠ACE基因的真核表达载体pEGFP-ACE，能够在HepG2细胞表达重组ACE蛋白，并获得了过表达ACE细胞株；卡托普利对细胞所表达的ACE的抑制作用，验证了本实验所构建的细胞株可作为ACEI类降压药物的筛

8、选模型。关键词血管紧张素