江浙蝮蛇毒诱导类风湿性关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究论文

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1、江浙蝮蛇毒诱导类风湿性关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究论文胡珏杨旭燕吕庆华许东航【关键词】江浙蝮蛇毒类风湿性关节炎滑膜细胞凋亡类风湿性关节炎（RA）是一种以滑膜增生、淋巴巨噬细胞浸润滑膜层并伴有少量的凋亡为特征的自身免疫性疾病。既往研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2在RA患者中较普通骨关节炎患者显著上调，从而抑制滑液成纤维细胞的凋亡，并导致RA患者滑膜的超常增生［１，２］。江浙蝮蛇毒（AgkistrodomhalysPallasvenom，ASV）的主要活性成分蛇毒蛋白有诱导凋亡和抗肿瘤作用，临床上已被用于治疗类风湿性关节炎等慢

2、性疾病所致的炎症和疼痛［３，４］。然而，ASV对RA患者的治疗作用机制尚未明确。作者自2007年2至7月检测ASV对RA患者滑液成纤维细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用。1临床资料1.1一般资料选择浙江大学附属第二医院骨科行膝关节置换术的RA患者6例.freelAb、羊-抗鼠-FITC-IgG-mAb，美国Caltag公司；碘化吡啶，美国Sigma公司。1.3滑膜细胞的分离和培养无菌条件下，从关节置换术获得的滑膜组织切成3～5mm的碎片，用胶原酶Ⅱ和等体积的DMEM培养基，在37℃、5%CO2孵箱中消化4h。常规离心，弃上清液后

3、加0.25%胰酶1ml，混匀后消化30min。1000r/min离心后弃上清液，加入含10%FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基，放至37℃、5%CO2孵箱中孵育，常规传代培养。1.4MTT法检测ASV对RA滑膜细胞活力影响调整细胞悬液浓度为7×104/ml左右，接种于96孔培养板中，每孔体积100μl，培养24h。加入不同质量浓度的ASV（1.25、2.5、5、10μg/ml），以溶剂为阴性对照，再入培养箱于相同条件下培养。分别培养24、48、72h后，每孔加入10μlMTT（5mg/ml

4、），在培养箱内放置3h，试验结束时吸去上清液，加入150μlDMSO，震荡10min，用酶联免疫检测仪于490nm处测定各孔吸光度（A）值，记录结果，计算抑制率。1.5细胞凋亡检测采用流式细胞仪结合碘化丙啶（PI）和AnnexinV-FITC双标记染色测定细胞凋亡率。取对数生长期细胞，细胞浓度为2×105/ml。分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10μg/ml），作用24、48h后，胰酶消化收集细胞。PBS洗涤细胞2次，用1×BindingBuffer重悬细胞，加入5μlAnnexinV-FITC，混匀，室温避光

5、孵育15min，再加入5μl的20μg/ml的PI，混匀后室温避光孵育5min，在1h内流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。1.6细胞周期分析取对数生长期的细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10μg/ml），作用24h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，70%冰乙醇固定，4℃保存。上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗涤2次。加入500μlPI（50μg/ml），4℃避光染色30min，用200目尼龙网过滤，上机检测。1.7Bcl-2蛋白表达分析取对数生长期的细胞，调整细胞浓度至5×

6、105/ml，分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10μg/ml），作用24h后，用含70%乙醇的PBS1ml渗透细胞30min，冲洗2次，弃上清液。加FITC标记的bcl-2单抗（1∶50）100μl，4℃下孵育30min，PBS洗2次。加FITC标记的羊抗鼠IgG（1∶200）100μl，4℃下孵育30min，PBS洗2次。用PBS代替单抗作阴性对照，立即进行流式细胞仪检测，bcl-2蛋白表达水平以阳性细胞百分率表示。1.8统计学分析全部实验结果均来自至少3组平行实验，数据用(x±s)表示。组间差异性比较采用S

7、PSS10.0软件进行单因素方差分析，P0.05有显著性差异。2结果2.1ASV对细胞增殖的影响MTT比色结果显示，不同浓度的ASV对体外生长的成纤维样滑膜细胞有增殖抑制作用。经1.25μg/mlASV处理的细胞生长受到轻微抑制，在ASV2.5～10μg/ml范围内，抑制作用呈时间和剂量依赖性，与对照组比较，细胞抑制率差异有统计学意义（P0.05）。据此，选择2.5、5、10μg/ml作为以下实验ASV的作用浓度。见图1。图1ASV对细胞增殖的影响2.2流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡率流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡结果表明滑膜细胞

8、加药处理后凋亡细胞百分率明显高于未加药组（P0.05）。当ASV浓度为5μg/ml和10μg/ml时，24h后与对照组相比凋亡百分率出现显著增加。并随时间的延长及药物浓度的增高，凋亡细胞数增加。见表1。表1不同浓度ASV对RA滑膜细胞凋亡率的影响（%）注：与正常对照组比较P0.05，**P0.012.