细胞密度调节结肠癌细胞整合素ανβ6表达——癌细胞永生化侵袭生长机制的研究

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1、细胞密度调节结肠癌细胞整合素ανβ6表达——癌细胞永生化侵袭生长机制的研究：杨广运　徐克森　潘忠清　齐桂苓　陈融　王金申　寿楠海　牛军【摘要】目的：探讨细胞高密度和细胞挤压状态对结肠癌细胞表面整合素ανβ6表达的影响效果，探讨结肠癌细胞永生化侵袭生长的机制。方法：用流式细胞术检测结肠癌细胞系ethods:Floetryancoloncancerline,MP-9的分泌［２］；文献报道ανβ6是唯一仅存于恶性上皮性肿瘤组织的整合素亚型，在结肠癌生长的各个时期持续表达，在体内和体外均可促进结肠癌增殖和侵袭生长［３－６］。但是在人结肠癌侵袭生长过程中，细胞密度对整合素ανβ6表达的影响却

2、未有文献报道。本研究通过观察细胞高密度和细胞挤压状态对结肠癌细胞表面整合素ανβ6表达的影响，探讨结肠癌细胞永生化侵袭浸润性生长的机制。1　材料与方法1.1　细胞株和试剂　人结肠癌细胞系icon公司；抗整合素ανβ6的功能性单克隆抗体2G2购自美国Biogen公司；FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白IgG和SP免疫组织化学试剂盒均购自深圳晶美公司。1.2　实验方法1.2.1　细胞培养　用人结肠癌细胞系2的细胞培养瓶中，植入约7.5×105活细胞，进行低密度培养；在24孔组织培养板中植入相同数量的活细胞，进行高密度培养。细胞培养基每天更换1次。1.2.2　检测细胞表面整合素ανβ6的表达

3、　用胰蛋白酶（Trypsin）/EDTA收集单层培养的细胞，羊血清在4°C下封闭10min，PBS漂洗1次，抗β6的一抗E7P6（10μg/mL）4°C孵化20min，PBS漂洗2次，以标记藻红蛋白的二抗羊抗鼠IgG（60μg/mL）4°C染色20min，然后PBS漂洗2次，取0.5mLPBS重悬液进行流式细胞术分析。测定各细胞表面ανβ6整合素的表达。1.2.3　组织芯片制备及免疫组织化学染色　随机选取山东大学齐鲁医院普外科2000年1月—2003年12月经病理组织学检查确诊的结肠癌存档蜡块100例。每个蜡块取两个点，一个取自高细胞密度的肿瘤侵袭生长的边缘部分（肿瘤浅表1/5），

4、另一点取自低细胞密度的肿瘤中心部分（肿瘤中央2/5）。按照文献［７－８］描述的方法制备200点的组织芯片。组织芯片常规脱蜡水化；胃蛋白酶（pepsin）37℃抗原修复15min，蒸馏水洗和PBS漂洗各2次，然后分别与抗ανβ6的一抗2G2（1:1670稀释）、二抗及过氧化物酶标记的链霉素亲和素抗体孵育，以PBS代替一抗作为阴性对照，PBS水洗后DAB显色15min，苏木精复染，封片观察。1.3　结果判定　ανβ6染色以细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，无阳性细胞记作0分，阳性细胞数≤25%记作1分，26%～50%记作2分，51%～75%记作3分，>75%记作4分；染色强

5、度：无染色记作0分，弱染色记作1分，中等强度染色记作2分，强染色记作3分。两者分值相加最后得分为判定标准：≤2分为阴性，3～7分为阳性（其中3～4分为阳性低表达，5～7分为阳性高表达）［9-11］。1.4　统计学处理　采用SPSS11.5软件进行统计分析，百分率比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。2　结果2.1　WiDr细胞和SW480细胞表面整合素ανβ6的表达　与低密度培养相比，高密度培养的WiDr细胞ανβ6表达增加，而SW480细胞ανβ6表达没有细胞密度依赖的增加（图1）。2.2　细胞密度对人正常角化细胞ανβ6表达的影响　人正常表皮角化细胞在细胞培养条件下表

6、达整合素ανβ6，HaCaT细胞在体内体外都表现一种单纯的正常生长分化模式［12－13］。将HaCaT细胞分别置于与WiDr细胞系完全相同的高、低密度条件下培养，未观察到HaCaT细胞存在细胞密度依赖的ανβ6表达增加，见图1。2.3　结肠癌的边缘组织整合素ανβ6的表达　结肠癌边缘组织多见ανβ6高表达，表达率为73.7%（28/38），低表达仅为26.3％（10/38）,且ανβ6密布于肿瘤边缘；而肿瘤中央组织以ανβ6低表达为主，表达率为71.1％（27/38）,而高表达率仅占28.9%（11/38）。ανβ6高表达率在肿瘤边缘与肿瘤中央差异有统计学意义（χ2=15.2，Ｐ&

7、lt;0.01，图2）。3　讨论　　癌细胞能克服正常细胞拥挤和密度积压障碍穿过基底膜而无限制的永生化生长，从本质上反映了细胞表面问题，可能与黏附分子整合素有关。目前，关于结肠癌等人上皮源性恶性肿瘤、细胞密度对整合素等黏附分子表达程度的影响未有文献报道。有研究报道α3、α6和β1整合素亚型在人膀胱癌和结肠癌组织中观察到了细胞密度依赖性的表达变化［14］。另外，结肠癌调节细胞生长的基因表达已被证明是细胞密度依赖性的，结肠癌细胞人工培养至融合状态，转化生长因子TGF-β和血