白藜芦醇影响HT-29结肠癌细胞转移侵袭分子机制的初步研究

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1、白藜芦醇影响HT-29结肠癌细胞转移侵袭分子机制的初步研究摘要：探讨白藜芦醇对结肠癌细胞株HT-29侵袭机理蛋白质水平的影响。用0~80μM白藜芦醇处理HT-29结肠癌细胞24h，采用蛋白质印记技术检测白藜芦醇对Bcl-2、cyclinD1蛋白质水平的影响。运用明胶酶谱法对明胶酶A（MMP-2）和明胶酶B（MMP-9）进行测定其活性。本实验均以β-actin为内参进行分析。白藜芦醇处理诱导Bcl-2蛋白质表达量增加、cyclinD1蛋白质表达量减少，β-actin蛋白质表达量不变。MMP-2、MMP-9酶活性降低。关键词：白藜芦醇；HT-29细胞；Bcl-2；MMP-2；MMP-9引言：白

2、藜芦醇（Resveratrol，Rev）化学名称为3，4′，5-三羟基-反-均二苯代乙烯，分子式C14H12O3，结构如图1.1所示，分子量228.2，以游离态（顺式-、反式-）和糖苷结合态（顺式-、反式-）两种形式存在，是一种植物抗毒素的多酚类活性单体，广泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物性食物或药物中。图1.1白藜芦醇结构式1940年人们首次从毛叶藜芦的根部分离获得白藜芦醇。白藜芦醇作为天然的肿瘤化学预防剂，对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用：能够抗突变、抗氧化、抑制自由基并诱导Ⅱ期药代酶（抗起始活性）；还能抑制环氧化酶（COX）的环氧化酶和过氧化氢酶双重活性，具有很强的抗炎作用

3、（抗促进活性）。还具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。近年来肿瘤发病率有上升的趋势。大量的体内、体外抗癌试验结果表明，白藜芦醇对多种肿瘤，如肝癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌、肺癌等均具有潜在的抗癌活性。鉴于白藜芦醇的潜在抗癌活性，加上和人类饮食关系密切，白藜芦醇已成为肿瘤防治中的研究热点。1.实验内容1.1实验试剂：白藜芦醇，1640培养基，GIBCO，青霉素，链霉素，L-谷氨酰胺(L-glutamine)，HEPES，PBS，0.25%胰酶细胞消化液，胎牛血清，二甲基亚砜(DMSO)，1640培养基，Western及IP细胞裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型），

4、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，Acryl/bissolution，TEMED，Western一抗稀释液，脱脂奶粉，Actin抗体，Bcl-2抗体，14-3-3抗体，cyclinD1抗体，辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，过硫酸铵，SDS，Tris，NaCl，Tween-20，甘氨酸，甲醇，BeyoECLPlus，浓盐酸，米吐尔，对苯二酚，溴化钾，无水亚硫酸钠，无水碳酸钠，硫代硫酸钠，硼酸，钾明矾，BeyoECLPlusA液，BeyoECLPlusB液，Tris-Hcl，TritionX-100，NaCl，Brij-35，考马斯亮蓝（R250），乙酸

5、，溴酚蓝，甘油，甲醇1.2实验仪器：生物安全柜，二氧化碳培养箱，二氧化碳钢瓶，高压蒸汽灭菌锅，电热恒温鼓风干燥箱，TGL-20M台式高速冷冻离心机，数显恒温水浴锅HH-1，超低温冷冻冷藏柜，MILLIQURE超纯水仪，冷藏冷冻冰箱，电子天平（型号为AL204），电泳仪，转膜仪，制冰机，电泳仪1.3.1HT-29细胞培养l细胞培养的准备1）玻璃器皿的清洗和消毒2）金属过滤器及其他器材的消毒3）无菌室的消毒l细胞培养及传代细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，于5%CO2，37℃培养箱中常规培养。待细胞长满至培养瓶底面积80%之后传代，全部实验均用指数生长期细胞。传代要根据细胞生长情况而定

6、。传代时间的长短与接种细胞的类型和数量的多少有关，加太稀或太密均影响传代时间。一般接种细胞密度范围为(2.5-5)×104细胞数/ml。1.3.2细胞的处理lRPMI1640培养液的配制l白藜芦醇溶液的配制1.3.3蛋白质浓度测定及标准曲线的制作lBCA检测步骤1）取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（30mgBSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。2）取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。3）根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。4）将标准品按0

7、，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。5）加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。6）各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置20-30分钟。7）测定OD值，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。1.3.4Westernblottingl细胞总蛋白的提取1）取经白藜芦醇白藜芦醇处理过的细胞，吸去培养基，用PB