流动注射化学发光法研究黄酮等物质清除超氧自由基的作用论文

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1、流动注射化学发光法研究黄酮等物质清除超氧自由基的作用论文.freelethodsＲｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｗｏｒｋｅｄａｓａｎｉｎｄｅｘｗｉｔｈｐｙｒｏｇａｌｌｉｃａｃｉｄｓｅｌｆ－ｏｘｉｄｅｉｎａｌｋａｌｉｎｅｍｅｄｉｕｍ．ResultsＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ，ｐｕｒｓｌａｎｅｈｅｒｂ，ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ，ｒｕｔｉｎｓｈｏｗｅｄｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌｓ．ConclusionＴｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｑｕｉｃｋ．Ｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ

2、ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Keywords：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅＲａｄｉｃａｌｓ生命活动的有氧代谢可以不断产生各种自由基，超氧阴离子自由基Ｏ－２·是其中３种有代表性的自由基（超氧阴离子自由基Ｏ－２·、羟基自由基ＯＨ·、酯自由基ＲＣＯＯ·）之一。［１］过剩的超氧阴离子自由基Ｏ－２·对生物细胞有巨大的破坏作用，是引起人体衰老和导致癌症、冠心病、动脉硬化等多种疾病诱因之一。清除生物体内过剩自由基..毕业，寻找能够清除活性氧自由基的抗氧化剂已成为医学

3、和生物学领域一项重要研究课题。目前常用的自由基检测方法有：电子自旋共振法［２］、电化学法［３］、毛细管电泳法、荧光光谱法、光度法、色谱法等［４］。这些方法存在仪器昂贵、操作复杂、选择性差或灵敏度低等缺点。与之相比，流动注射化学发光法具有灵敏、快速、操作简单、重现性好等优点，近年来常用于自由基抗氧化剂的研究和筛选。本研究基于碱性条件下，邻苯三酚自氧化产生Ｏ－２·自由基，氧化肾上腺素产生化学发光的现象，建立了检测超氧阴离子自由基新体系，并成功应用于黃酮等物质对超氧阴离子清除能力的检测。１仪器与材料化学发光仪（中国科学院生物物理研究所）；恒流泵（上海青浦）；ＢＳ１２４Ｓ

4、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；ＰＨＳ－３Ｃ精密ｐＨ计（上海精密科学仪器有限公司）。邻苯三酚储备液：以１０ｍｍｏｌ／ＬＨＣｌ配制成０．１ｍｏｌ／Ｌ溶液，贮于冰箱，临用前稀释；盐酸肾上腺素标准品（中国药品生物制品检定所）：１．０×１０－３ｇ／ｍｌ，用重蒸水配制于棕色容量瓶中，贮于冰箱，临用前稀释；０．１ｍｏｌＮａ２ＣＯ３－ＮａＨＣＯ３缓冲液；所有试剂均为分析纯，水为重蒸水。芦丁（生化试剂，上海试剂二厂）、槲皮素（Ｆｌｕｋａ公司产品）储备液：各准确称取０．５ｍｇ，分别用少量甲醇溶解后，二次蒸馏水定容于５０ｍｌ容量瓶待用。２方法２．１样品中黃酮类物质的提取及试

5、样制备干杭白菊（购于市场）→粉碎→１０倍量９５％乙醇浸泡１ｈ，回流提取２次，每次９０ｍｉｎ→残渣用９５％乙醇洗至无色，合并滤液→减压浓缩→乙醇提取物。马齿苋（自采）→干燥粉碎→石油醚（６０～９０℃）脱脂两次（每次１ｈ）→弃石油醚提取液→挥干浸膏石油醚→１０倍量９５％乙醇回流提取两次，每次１ｈ→合并滤液→减压浓缩→乙醇提取物。２．２超氧阴离子自由基Ｏ－２·检测方法如图１所示，分别将邻苯三酚、缓冲溶液和肾上腺素通过相应管道泵入分析系统，邻苯三酚、缓冲液和肾上腺素混合后产生化学发光信号，待信号稳定后，注入清除剂，以相对峰高计算发光抑制率。P.蠕动泵V.阀F.流通池W.废

6、液D.检测器PC.计算机图1流动注射化学发光仪示意图（略）２．３清除剂检测原理发光体系信号稳定后，依次泵入不同浓度的自由基清除剂，每个浓度测定３次，取平均值，以空白对照的发光强度为１００％，注入清除剂后发光强度下降，发光抑制百分率用以下公式计算：抑制百分率（%）＝空白对照峰高样品峰高空白对照峰高×１００％3结果与讨论３．１超氧阴离子自由基Ｏ－２·检测体系的优化３．１．１邻苯三酚浓度的优化在碱性介质中，邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子自由基Ｏ－２·，对其浓度的选择是至关重要的。本研究考察了１．０×１０－２～１．０×１０－６ｍｏｌ／Ｌ范围内不同浓度的邻苯三酚对发光强度的影

7、响。实验结果表明，当邻苯三酚浓度超过５．０×１０－４ｍｏｌ／Ｌ时，发光强度呈下降趋势，且实验重复性降低，故本研究选择邻苯三酚的浓度为５．０×１０－４ｍｏｌ／Ｌ。３．１．２肾上腺素浓度的影响考察了１．０×１０－３～１．０×１０－６ｇ／ｍｌ肾上腺素对体系化学发光强度的影响，发现发光强度随肾上腺素浓度的增加而增加。当肾上腺素浓度达到２．０×１０－５ｇ／ｍｌ后，继续增大肾上腺素浓度，发光强度降低，本研究选用２．０×１０－５ｇ／ｍｌ肾上腺素。３．１．３缓冲溶液及ｐＨ值的影响考察了同浓度的ＫＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４，ＮＨ３－ＮＨ４Ｃｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ＨＡｃ－ＮａＡｃ，硼

8、砂，Ｎａ２