ATP通过调节AMPK信号诱导巨噬细胞炎症小体活化和细胞焦亡

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英文对照）：ATP通过调节AMPK信号诱导巨噬细胞炎症小体活化和细胞焦亡ATP-inducedinflammasomeactivationandpyroptosisisregulatedbyAMP-activatedproteinkinaseinmacrophages作者姓名：魏红霞指导教师姓名及学位、职称：欧阳东云博士研究员学科、专业名称：细胞生物学学位类型：学术学位论文提交日期：2017年5月论文答辩日期:2017年6月答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：

2、2017年6月29日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论

3、文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：暨南大学硕士学位论文ATP通过调节AMPK信号诱导巨噬细胞炎症小体活化和细胞焦亡硕士研究生魏红霞专业细胞生物学导师欧阳东云研究员暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系摘要目的：巨噬细胞是机体抗感染最重要的固有免疫

4、细胞之一，也是联系固有免疫和适应性免疫的纽带。巨噬细胞通过其细胞表面或内部的特异性识别受体（PRR），识别病原相关分子模式（PAMP），从而启动炎症反应，并上调炎症小体组成成分（如NLRP3、pro-caspase-1和pro-IL-1β等）的表达；如果巨噬细胞在损伤相关分子模式（DAMP）信号（即危险信号分子）的进一步刺激下，上述炎症小体成分可组装成具有活性的炎症小体，释放成熟的caspase-1和IL-1β等，或诱导细胞程序性死亡（焦亡）。细菌脂多糖（Lipopolysaccharides,LP

5、S）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组分之一，位于其细胞壁的外壁层。在人体免疫系统对抗细菌入侵时，LPS作为PAMP被巨噬细胞的PRR所识别，而ATP是由细菌或宿主细胞在细菌感染或组织损伤的情况下释放的危险信号分子，LPS激活的细胞在ATP的进一步刺激下，诱导炎症小体活化，进而诱导细胞焦亡。以前有研究发现，ATP处理可以导致腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的活化。AMPK是细胞能量代谢的感受器。然而，AMPK信号通路是否参与以及如何参与ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的调控，目前尚不明确。本研究以LPS活

6、化的巨噬细胞为模型，包括小鼠巨噬细胞系J774A.1、巯基乙酸盐（thioglycollate,TG）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠骨髓体外培养诱导的巨噬细胞（BMDM），探讨胞外ATP诱导炎症小体活化和细胞焦亡与AMPK信号通路的关系。本项目还将探讨AMPK信号通路调控对细菌感染的小鼠脓毒症模型生存率的影响，验证该信号通路对炎症小体活化和细胞焦亡的调控作用机制。方法：LPS处理巨噬细胞，可上调炎症小体相关组分（包括NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β）的表达；在ATP的进一步作

7、用下，NLRP3招募凋亡相关斑点样蛋白（apoptosisassociatedspecklikeproteincontainingaCARD,ASC）（ASC因此聚集成speck），共同组装成有活性I暨南大学硕士学位论文的炎症小体，激活caspase-1，并将pro-IL-1β剪切加工，细胞发生焦亡，释放成熟的IL-1β和HMGB1。因此，本论文利用多种方法检测LPS+ATP激活炎症小体和细胞焦亡，以及AMPK信号对上述炎症小体和细胞焦亡的调控作用：由于发生焦亡的细胞其细胞膜上形成众多孔隙，使细胞膜

8、失去完整性，故采用碘化丙锭（PI）染色法检测细胞焦亡；免疫印迹法检测细胞胞内及上清中IL-1β、HMGB1和caspase-1的表达水平，指示炎症小体激活和细胞焦亡的发生；免疫荧光技术检测巨噬细胞P2X7嘌呤能受体（P2X7R）以及ASC的亚细胞分布及荧光强度；CBA试剂盒（内含结合相应抗体的免疫微球）结合流式细胞术检测细胞培养上清或实验动物血清中的IL-1β表达水平；流式细胞术检测二甲双胍对小鼠腹腔中中性粒细胞比例的影响；利用二甲双胍作为AMPK激动剂，或compo