a族链球菌m蛋白在诱导巨噬细胞活化及调节中的作用

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签纠篆本≯导师签章嬲?学院领导盖载粪鋈c,]ol号年唯月／日研究生学位论文独创性声明‘·、本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研

2、究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：j冶彳≥导师签章：旃芎≥吖弓年匕月／El目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4研究论文A族链球菌M蛋白在诱导巨噬细胞活化及调节中的作用—1上．—jL一日IJ百⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．28附表⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．43参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44综述A族链球菌M蛋白的分型及致病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．46致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56中文摘要A族链球菌M蛋白在诱导巨噬细胞活化及调节中的作用摘要目的：A族链球菌(GroupAstreptOCOCCUS，GAS)是一种以人类为唯

4、一宿主的细菌，感染后若治疗不及时可引发多种严重的疾病。本室在GAS致炎机制及免疫逃逸方面做了大量工作。M蛋白位于GAS的表面，是它的主要的毒力因子，研究显示M蛋白有着较强的致炎能力，且有助于GAS逃避巨噬细胞的吞噬。结合本室前期工作，本课题对M蛋白在诱导及调节巨噬细胞活化方面做继续研究。巨噬细胞是机体重要的效应细胞，活化的巨噬细胞可以分泌促炎症因子女I：IIL．1p、IL．6、TNF．0【等，这些因子在诱导炎症反应、抗感染免疫中发挥着重要作用。炎症的发展过程中受许多负调控因子的作用，我们对肿瘤坏死因子13,诱导蛋白3(A20)予以了特别的关注，A20是炎症信号传导的中心

5、一转录因子NF．rd3的抑制因子，而M蛋白对A20的诱导产生，发挥作用有着怎样的影响?同时IL．10是一种强烈的抑制单核巨噬细胞分泌炎症因子的细胞因子，在巨噬细胞受到M蛋白刺激时它的表达情况如何?细胞因子信号转导抑制子(SOCS)是细胞信号JAK／STAT通路以及MYD88／NF．r,B通路的负调控因子，在M蛋白所致巨噬细胞炎症发展过程中它的表达量如何?对于以上疑问，本课题旨在做初步研究。因此，在本研究中我们首先表达了M蛋白，同时构建并表达另一种由GAS分泌的蛋I刍SpeB作为对照蛋白，通过对比两种蛋白分别刺激巨噬细胞后的促炎细胞因子及相关负调控因子的表达情况来验证M蛋

6、白是否与其他GAS相关蛋白在促进炎症以及表达负调控因子方面是否存在差异，以期为今后在M蛋白诱导巨噬细胞负调控因子表达方面更深入的研究奠定基础。通过以上工作，旨在深化对于GAS的认识，以期为临床更精确的靶向治疗提供实验依据。方法：1目的蛋白制备：将本室已有的含有M蛋白表达质粒pEGX2．T的贮存菌DH-5a提取质粒并转染表达菌E．coliBL21，用IPTG诱导表达M蛋白，经SDS．PAGE鉴定后，纯化，定量。构建SpeB蛋白的表达质粒pET28a．SpeB，中文摘要转染表达菌E．coliBL21后表达蛋白，纯化，定量。2细胞毒性试验以及蛋白作用浓度的选择：首先MTT法检

7、测M蛋白和SpeB蛋白的细胞毒性，鲎试剂盒检测融合蛋白LPS含量，然后参考以0．1、1、5、10}tg／ml浓度的M蛋白作用于巨噬细胞RAW264．7后A20的表达情况，以确定适合刺激浓度。3以PBS为阴性对照，以LPS为阳性对照(用量10ng／91)，M蛋酐[1SpeB蛋白分别刺激RAW264．7细胞后细胞因子的表达：以1099／ml浓度的M蛋白和SpeB蛋白分别刺激RAW264．7细胞2、4、8、12d,时后行Realtime—PCR检测细胞因子IL．1p、IL．6、TNF一仪以及负调控因子A20、IL．10、NOeSl和ISOCS3