自噬在ald-dna诱导sle发病中的作用调节巨噬细胞baff的表达

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1、硕士学位论文论文题目自噬在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用：调节巨噬细胞BAFF的表达研究生姓名李百慧指导教师姓名熊思东专业名称免疫学研究方向自身免疫病论文提交日期2013年6月自噬在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用：调节巨噬细胞BAFF的表达中文摘要中文摘要目的：探讨自噬在SLE发病中的作用。方法：首先对系统性红斑狼疮（SLE）病人外周血淋巴细胞（PBMC）中自噬相关基因的mRNA水平进行检测，对自噬是否参与SLE的发病进行初步评价。其次用活化淋巴细胞来源DNA（ALD-DNA）采用皮下多点注射方

2、法隔周免疫6-8周龄BALB/c小鼠，三次免疫后检测血清anti-dsDNA抗体水平和小鼠尿蛋白水平，对小鼠肾脏做病理切片H&E染色，以及检测肾脏免疫复合物沉积，判断SLE小鼠模型是否成功建立。对SLE小鼠外周血淋巴细胞中自噬相关基因的mRNA水平进行检测。而后在ALD-DNA诱导的SLE小鼠模型中用Beclin1-shRNA下调自噬，通过对小鼠anti-dsDNA抗体、尿蛋白、肾脏病理的检测，判断SLE病情是否得到改善。选择巨噬细胞为研究对象，用WesternBlot对SLE小鼠肾脏和脾脏巨噬细胞进行自噬

3、标志分子LC3进行检测。进一步在体外以巨噬细胞系RAW264.7为研究对象，确定ALD-DNA刺激下巨噬细胞中自噬的发生：WesternBlot检测LC3变化；用GFP-LC3质粒转染RAW264.7，再用ALD-DNA刺激，检测GFP-LC3的胞内定位情况。进而利用3-MA抑制自噬，检测巨噬细胞功能：用Griess法测NO含量检测巨噬细胞NO分泌情况、流式细胞术检测CD80和CD86分子为标志的巨噬细胞活化情况，ELISA和Real-TimePCR检测SLE相关细胞因子，包括IL-6，IL-8，TNF-α

4、，IL-10，IL-1β，TGF-β和BAFF表达水平的改变。通过FITC微球吞噬检测在自噬发生与抑制情况下巨噬细胞吞噬能力的改变。最后，我们针对BAFF如何受到自噬的调控进行探讨，通过WesternBlot检测与BAFF相关的信号通路，确定自噬调控BAFF的途径。结果：SLE病人PBMC中atg5的mRNA水平约高于正常人36倍，beclin1的mRNA水平约高于正常人5倍，lc3b的mRNA水平约高于正常人45倍。在ALD-DNA三次免疫后，小鼠anti-dsDNA抗体水平和尿蛋白水平升高，肾小球肾炎明

5、显，肾脏免疫复合物沉积增多，表明我们成功建立SLE小鼠模型。SLE小鼠PBMC中atg12的mRNA水平约高于正常组45倍，atg5的mRNA水平约高于正常组100倍以上，beclin1的mRNA水平约高于正常组150倍左右。而后，我们在I中文摘要自噬在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用：调节巨噬细胞BAFF的表达ALD-DNA诱导SLE的同时用Beclin1-shRNA免疫小鼠，发现具有良好的保护效果：尿蛋白水平下降，抗核抗体水平下降，以及肾脏病理情况的改善都表明自噬的抑制能缓解ALD-DNA诱导SLE

6、的发病。Westernblot结果显示，在ALD-DNA诱导的SLE小鼠脾脏和肾脏巨噬细胞中，LC3显著高于对照组与正常组，即SLE小鼠巨噬细胞自噬水平显著高于较对照组。利用巨噬细胞系RAW264.7进行体外研究，证实ALD-DNA的刺激可以直接诱导巨噬细胞自噬水平的升高：WesternBlot显示ALD-DNA在RAW264.7中上调LC3，并促使GFP-LC3从弥散分布转变为点状聚集。ALD-DNA能够在巨噬细胞中直接激活自噬这一结果提示自噬可能在ALD-DNA诱导的SLE发病中发挥重要的作用。3-MA

7、抑制自噬后，巨噬细胞功能发生显著改变，其中检测到CD80、CD86分子表达水平随自噬的抑制而下降；NO分泌减少；CD80、CD86分子表达降低；巨噬细胞中细胞因子的变化复杂：IL-6，IL-8，TNF-α和BAFF在自噬受到抑制后显著下降；MCP-1表达上升；IL-10，IL-1β，TGF-β的改变不受影响。最后，我们对自噬调节BAFF的表达调控进行机制探讨，发现自噬被抑制后，IKKα水平下降，IκB水平升高，NF-κBp65水平下降，因此得出结论：自噬通过调节NF-κBp65信号通路调节BAFF的表达。结

8、论：自噬在ALD-DNA诱导的SLE发病中扮演重要的作用；抑制自噬可以缓解ALD-DNA诱导的SLE发病。自噬对巨噬细胞的BAFF表达及其他功能有显著调节作用，其对于BAFF的表达调控主要通过NF-κBp65信号通路。关键词：自噬；SLE；巨噬细胞；BAFF；NF-κBp65作者：李百慧指导老师：熊思东II自噬在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用：调节巨噬细胞BAFF的表达英文摘要Autophagypartic