中药联合褪黑激素对帕金森模型大鼠前脑纹状体细胞凋亡和行为学的影响

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1、中药联合褪黑激素对帕金森模型大鼠前脑纹状体细胞凋亡和行为学的影响：严丽荣周亚平苗曼悌王林仙徐金张晔周志强刘益仁狄荣科【摘要】目的观察中药(平颤方)联合褪黑激素（MT）对帕金森病(PD)模型大鼠行为学和前脑纹状体细胞凋亡的影响，探讨中药联合MT治疗PD的作用及其机制。方法SD大鼠60只，分5个组：空白对照组、模型对照组、MT组、中药组、中药+MT组。模型对照组和各治疗组大鼠腹腔注射N甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）建立PD模型，用爬杆法和迷宫试验测量大鼠行为学改变和智力状况，Bax/Bcl2免疫组织化学染色和Tune

2、l法检测前脑纹状体凋亡细胞。结果PD大鼠出现不同程度爬杆能力下降和智力减退；与病理对照组相比，用药实验组尤其是中药+MT组大鼠行为学异常可部分或全部改善（P＜0.05），前脑纹状体神经元和胶质细胞Bcl2蛋白表达明显增强（P＜0.01），Bax基因表达受抑制（P＜0.01），同时前脑黑质纹状体通路细胞凋亡减少（P＜0.01）。结论中药平颤方联合MT通过抗氧化应激途径，激活Bax/Bcl2系统，调节前脑黑质纹状体通路多巴胺（DA）神经活性，抑制细胞凋亡和改善PD症状。【关键词】中药平颤方；褪黑激素；N甲基4苯基1,2,3,6四

3、氢吡啶；细胞凋亡；帕金森病帕金森病(PD)在中医学中属于“颤证、颤振”范畴，中老年人肝肾亏虚，髓海不足，虚风内动是本病发病之源〔1〕。临床应用左旋多巴替代内源性多巴胺(DA)的缺乏，可改善PD症状，但大多数病人服药一段时间后疗效减退，出现运动障碍、智力减退和精神症状等副作用。根据中医对PD的认识并结合临床经验拟定中药平颤方，观察中药联合褪黑激素（MT）对前脑纹状体细胞凋亡的影响及功能的改善，探讨其联合治疗PD的作用及机制。　　1对象与方法　　1.1对象　　雄性SD大鼠，体重255～305g（鼠龄6～8g/ml，30mg/kg腹腔注射，每日

4、1次，共7d。再用爬杆法进行筛选，筛选48只PD模型(1.5～2.0分)大鼠进入实验；随机抽取36只作为治疗组（中药组、MT组、中药组+MT组，每组12只），其余12只作模型对照组。总共入选大鼠60只，每组均为12号。　　1.2方法　　各治疗组和模型对照组大鼠于末次注射MPTP及用药/水后7、14、21d，进行爬杆试验，每只大鼠允许爬杆3次，计算平均分。爬杆实验用直径35mm、高1000mm的光滑不锈钢管，垂直竖立，将大鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为，并按标准计分，评分标准如下：四肢并用，一次顺利

5、从杆上爬下为0分；一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行为的为0.5分；上杆后间歇停顿数次后爬下，但可抱紧金属杆为1分；滑行后掉落为1.5分；不能抓杆，直接掉落为2.0分。同时对所有动物进行“T”形迷宫实验，测定动物智力状况，每只大鼠走迷宫3次，计算平均错误次数。　　1.2.1中药配方及治疗　　中药平颤方由黄芪、天麻、银杏叶、白芍、钩藤、连翘、生甘草、野生葛根、大叶红景天、黄连等组成，制成浓缩煎剂。每日20:00胃饲中药除平颤方煎剂3ml（相当于中药10g），同时腹腔注射MT10mg/kg，连续治疗21d；模型对照组，每日同时胃饲3ml生理

6、盐水和腹腔注射1ml生理盐水。MT（Sigma公司产品）使用前先用无水乙醇溶解，然后加生理盐水稀释，MT初始浓度为3mg/L,使用前调至所需终浓度，其中无水乙醇浓度小于0.5％(V/V)。　　1.2.2取材和切片制备　　各组动物分别于末次注射MPTP后用药/生理盐水治疗7、14、21d,用10%水合氯醛麻醉，0.9%生理盐水150ml经心脏快速灌注冲洗，再用4.0%多聚甲醛200ml灌注。取右侧半脑，10%甲醛固定48h以上。以松果体为标志，向头侧横向切取3段，每段厚2mm，前段为纹状体最大分布区。石蜡包埋，连续切片，片厚5μm，取4套切

7、片，分别用于HE染色，Bax/Bcl2免疫组织化学染色和Tunel法细胞凋亡染色。　　1.2.3Bax/Bcl2免疫组织化学染色　　采用SP法，兔抗鼠Bax、Bcl2抗体及生物素羊抗兔IgG（购于武汉博士德生物技术公司）。切片脱蜡后，用3%甲醇过氧化氢孵育20min，将切片置于10%牛血清蛋白30min，分别在切片上加入Bax、Bcl2（1∶200）抗体，在温箱内过夜。次日加生物素IgG（1∶100）37℃反应30min。用0.01mmol/LPBS（pH7.4）充分洗涤，DBS/H2O2显色，常规脱水，透明和封固。　　1.2.4

8、Tunel法细胞凋亡染色　　将切片脱蜡水合，蛋白酶K（20mg/L）室温下消化30min，正常小牛血清37℃孵育1h，加入Tunel混合反应液，37℃温箱反应2h，3%H2O2封闭15min，