氯噻啉时间分辨免疫分析方法研究

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1、氯噻啉时间分辨免疫分析方法研究摘要：基于多克隆抗体建立了氯噻啉的时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）方法。采用氯噻啉半抗原与卵清白蛋白（OVA）的偶联物包被96孔板为固相抗原，与样品中游离的氯噻啉共同竞争Eu3+标记的抗氯噻啉抗体，用直接竞争法检测样品中的氯噻啉，在水和土壤中分别添加氯噻啉标准溶液，平均回收率为81.7%～103.8%，变异系数为3.9%～10%，符合农药残留检测要求，该TRFIA方法可用于环境与中氯噻啉残留高灵敏度检测。关键词：氯噻啉多克隆抗体时间分辨免疫分析中图分类号：S482文献标识码：A文章编号：1672-5336（2013）24-0000-00氯噻

2、啉（imidaclothiz）是我国公司自主研发一种新烟碱类杀虫剂，与常规杀虫剂没有交互抗性，因而可用于抗性治理，广泛应用于那些对有机磷类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类已产生抗性的农林业害虫的防治[1]。由于其具有高效、广谱、低毒等优点，氯噻啉使用量日益上升，不合理的使用也经常出现，对环境造成很大压力，因此，研制快速廉价、灵敏度高、稳定性好和筛通量大的检测氯噻啉残留的常规方法，加强对氯噻啉药物的检测和控制是一项刻不容缓的工作。7目前，有关氯噻啉残留检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC）[2-4]。但前处理过程比较繁琐，检测结果受样品净化、浓缩等步骤的影响，不适合进行批量样品

3、的快速检测。而免疫分析技术具有很高的精确度、更灵敏的反应，更强的特异性、不高的技术要求、更短的检测时间和大批量测定等优点，越来越受到人们的重视。抗氯噻啉农药的多克隆抗体的酶联免疫分析技术（ELISA）也有报道[5]，然而该方法检测灵敏度不太理想。时间分辨免疫分析技术具有高灵敏性、高选择性、快速等优点，可以弥补普通ELISA免疫分析技术灵敏度的不足。本研究建立了氯噻啉的TRFIA残留检测方法，为环境与食品中痕量氯噻啉残留高灵敏检测提供技术支持。1材料与方法1.1材料96孔聚苯乙烯荧光板（江苏省原子医学研究所）；95%氯噻啉原药（南通江山农药化工股份有限公司）；卵清蛋白（OV

4、A）、正三丁胺、氯甲酸异丁酯（Sigma公司）；Eu3+标记盒为PerkinElmer公司产品；荧光增强液，（江苏省原子医学研究所）；碳酸盐缓冲液（CBS）：0.05M，pH9.6；磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01M，pH7.4；氯噻啉多克隆抗体为本实验自行制备；二甲亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氢钾、氢氧化钾等试剂均为分析纯。1.2包被原的合成7氯噻啉的半抗原合成参照文献[5]，将合成的半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联通过混合酸酐法制备包被抗原。反应液用PBS在4℃下透析3天。根据三者在280nm的摩尔吸光系数（ε）估算半抗原与载体蛋白的偶联比[10]：结

5、合比=（ε偶联物-ε载体蛋白）/ε半抗原。1.3包被板的制备包被抗原用0.05MpH9.6CBS溶液稀释至5μg/mL，加入到96孔微孔板中（100μL/孔），4℃包被过夜，弃去包被液，加入封闭液，每孔200μL，37℃孵育2h，弃去封闭液，真空抽干，-20℃冷冻保存。1.4Eu3+标记抗体的制备取适量的PBS溶解的抗氯噻啉的抗体，在4℃下碳酸盐缓冲液（0.05M，PH8.5）透析2次，每次24h，目的是除去溶液中NaN3并且转换成碳酸盐缓冲液。在碳酸盐缓冲液环境中用DTTA-Eu3+标记抗体。取0.5mg上述透析的抗氯噻啉的抗体加入含0.2mg的DTTA-Eu3+的小瓶

6、中，室温下磁力搅拌反应24h。将Eu3+标记抗体溶液加入到SephadexG-50层析柱中，用含0.9%NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱。收集层析柱流出液（1mL/管），逐管测量其吸光值（A280nm），合并峰管。以Eu3+标记试剂盒说明书提供的方法测定并计算抗体标记率。1.5回收率的测定河水经过滤，添加不同浓度（0.05-0.57mg/L）的氯噻啉标样，用含甲醇的PBS稀释，直接用于TRFIA测定。称取10g土壤，添加不同浓度（0.05-0.5mg/kg）的氯噻啉标样，静置一段时间，加入40mL二氯甲烷进行超声提取，4000r/min离心。取上清液20mL减压浓缩，

7、用含甲醇的PBS定容到10mL。每个处理设3个重复，各设一个空白对照，用建立的TRFIA法对样品进行分析。1.6分析测定取准备好的酶标板，加入50μL的氯噻啉标准品或处理好的样品溶液到酶标孔中，加Eu3+标记抗氯噻啉抗体（50mmol/LpH7.4的PBS稀释）100μL，室温振荡孵育30min，用含0.1%吐温-20的Tris-HCl（50mmol/LpH7.8）洗涤液洗6次。加200μL增强液，振荡孵育5min后，用荧光检测仪进行测定。2结果与分析2.1包被原的鉴定对氯噻啉半抗原、OVA及偶联物进行紫外全波长扫描，发现偶联