时间分辨荧光免疫法测定甲胎蛋白方法研究

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1、时间分辨荧光免疫分析法测定甲胎蛋白方法研究时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolvedfluoroimmunoassayTRFIA)利用具有双功能基团的鳌合剂将铜系元素标记到抗原或抗体上形成免疫复合物c稀土离子一鳌合剂一抗原或抗体鳌合物)，利用时间分辨荧光仪即可测量该免疫复合物中悯系元素发射的荧光强度，从而对待分析物质进行定量。该方法消除了传统荧光免疫分析法的背景荧光干扰，具有酶免疫分析法操作简便、易自动化和放射免疫分析法的高灵敏度的特点，成为目前生物医学研究和临床生化检测中很有前途的超微量分析方法。TRFIA有两种分析系统:第一种称为

2、解离增强悯系荧光免疫分析(DEFIA);第二种是一次鳌合固相分析(CyberFluor)，它以具有双功能团的4,7-(氯磺酸基苯基)-1,10一菲咯琳-2,9一二狡酸(BCPDA)作为鳌合剂，只经一次鳌合并以固相形式测定荧光强度。由于BCPDA结构中含有两个异芳香氮基和两个羚基共同构成三价稀土离子赘合部分，可与三价稀土离子结合形成非常稳定的化合物，具有荧光增强作用，因而CyberFluor己成为TRFIA.技术的一个重要发展方向。甲胎蛋白(AFP)与个体发育、组织再生、肿瘤发生等密切相关，对其进行定性(量)分析己成为临床上肝癌早期诊断的金标准

3、。由于目前对AFP进行精确定量的分析方法基本都采用放射免疫分析法，因而深入研究用具有更大优越性的TRFIA技术检测AFP具有现实意义。、..__，__.在研究过程中，以BCPDA作为鳌合剂，对液相中BCPDA与IMaNfTL体(AFPAb)的标记条件以及标记物的荧光性质进行研究。将过量的BCPDA溶液与AFPAb溶液混合，待反应完成后，分离除去过量的BCPDA即可得到BCPDA与AFPAb的结合物AFPAb-BCPDA。初步建立了对AFPAb-BCPDABCPDA分别进行定量测定的方法，并对AFPAb的生物活性进行中蛋白质和了测定。在此基础上

4、，将AFPAb-BCPDA与Eu3`鳌合形成了AFPAb-BCPDA-Eu3`化合物，用荧光仪对其荧光性质、荧光寿命、检测限进行测定。通过BCPDA与AFPAb的标记条件、分离方法、检测方法进行研究表明，标记体系的最佳标记条件为:BCPDA以不超过总体积2%DMF溶解;在室温0:1(BCPDA盐体系;在此条用1.0X14cm的淋洗速度为6-8A#9S&'--eF1pT#P5h}Aa`B;bd.Ce})ix_t;P彰DGsTA}-5-0k"jrI}7:fMitI#JfiYt3W,0翻JJV}fki#tEp;rhHLi;LdtJJ386.'0}.

5、8h纂:1J-#}38Ip.2Ha:1}1)t;}5,9}7.16Ai1#2TK0Mi}l:f1frgl-}&a1i,l}4光度法测定标记物中的BCPDA的含量。对BCPDA-AFPAb-E矿+的荧光性质研究表明:当Eu3'浓度与BCPDA浓度相同，温浴时间为60min,pH7.8的Tris-HC1体系中荧光强度最强.对荧光寿命测定表明标记物的荧光寿命为883.04土0.01us，证明该体系可用于时间分辨荧光免疫分析中。该体系的荧光检测限为1.26X10-'0moUL。为提高分析方法的灵敏度，在单标记体系的基础上将生物素(B)一亲合素(A)体

6、系引入到免疫反应中，简称BAS系统。首先将生物素活化，用活仕生物素标记抗体。形成AFPAb-B，进而将亲和素与BCPDA进行标记，形成A-BCPDA，生物素与亲和素是具有高亲和常数的一对物质，因此将前两步所得物质混合可制得AFPAb-B-A-BCPDA。将所得的AFPAb-B-A-BCPDA与Eu3十鳌合形成AFPAb-B-A-BCPDA-Eu3s，用荧光仪检测其荧光强度。亲和素与BCPDA的标记实质即为蛋白质与BCPDA的标记，因此采用与单标记体系相同的标记条件和荧光实验条件，在上述条件下检测限降为1.68X10-"mo11L-多荧光标记体

7、系又称为多级放大标记体系，是在BAS体系的基础上，将亲合素与甲状腺球蛋白偶联，制备出一种大分子复合物，这个大分子复合物是由亲合素一甲状腺球蛋白一BCPDA，甲状腺球蛋白一BCPDA与Eu3-按1:3.3:480的摩尔比组成的，非常稳定，试剂可以保存几年，BCPDA的最低检出限可以进一步降低至5.25X10-13moULo在深入研究单标记体系的基础上引入了具有国际先进性的BAS体系和多级放大标记体系，提高了反应的灵敏度，并为标记免疫分析的研究提出了新的方向。该实验中由于用样量少，实验中所需反应瓶等玻璃器皿均为根据实验需要自制而成，实验装置，流程

8、也是自行设计的。通过对标记条件、荧光条件的研究为将该体系引入固相反应奠定了基础，然而，由于时间有限，对这两大体系的研究还有待于进一步完善，进一步提高检测的灵敏度。可