时间分辨荧光免疫研究法测定甲胎蛋白临床评价

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1、时间分辨荧光免疫研究法测定甲胎蛋白临床评价(抚顺市中心医院，辽宁抚顺113006)❷❷摘要：目的：评价时间分辨荧光免疫分析法测定甲胎蛋白的临床应用价值。方法：分别用时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫吸附法进行AFP测定，进行相关性分析、精密度试验和线性分析。结果：两法呈正相关，都有较好的重复性，但时间分辨荧光免疫分析法的CV值明显小于酶联免疫吸附法，时间分辨荧光免疫分析法比酶联免疫吸附法具有更宽的检测范围。结论：应用时间分辨荧光免疫分析法检测AFP,具有灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，有着良好的发展前景。❷关键词：甲胎蛋白；时间分辨荧光免疫分析；酶联免疫吸附❷中图分类号:R446.6

2、文献标识码:A文章编号：1673-2197(2009)03-0104-02❷甲胎蛋白(AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白,分子量约68000,由96%蛋白质和4%的碳水化合物组成，成人由肝细胞产生，血清中含量极微。AFP是诊断肝癌最特异的标志物[1],其灵敏度和特异性已经达到甚至远远超过CT、MRT、同位素扫描、超声波检查和血清酶学检查，同时检测孕妇血清中的AFP含量可用于神经管缺损畸胎的筛查。这些领域均须对AFP进行定量测定，临床上检测AFP的方法有很多，本文采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)对65份血清进行AFP测定，报告如下。❷1材料与方

3、法❷1.1病人与标本❷本院2007年8月-12月收治的65例肝癌患者，血清学AFP检测阳性，经影像学、组织病理学检查确诊为原发性肝癌，抽取肝癌住院患者晨血5mL,EDTA抗凝。将其中15份血清混合后分装(用于精密度试验)，置于-2CTC冰箱中保存,集中测试。❷1.2仪器与试剂❷TRFIA采用WALLAC公司生产的AutoDELFIA1235型全自动时间分辨荧光分析仪，测定试剂盒为苏州新波生物技术有限公司生产，自带标准物，检测过程均按照试剂盒说明书进行操作，ELISA采用美国Bioeheek公司产品，定量试剂盒为郑州博赛生物工程有限责任公司生产。❷1.3检测方法❷(1)TRFIAoAFP

4、标准品和样品25uL/孔〜分析缓冲液200UL-*室温慢速振动60min-＞洗板2次已稀释(1:50)的Eu3+标记溶液200uL—室温慢速振动60min^洗板6次一增强液200uL-室温慢速振动孵育5min-测定荧光值，自动计算AFP值。❷(1)ELISAo稀释液100uL/孔一血清样本20uL-37°C孵育30min-洗板4次一酶标抗体150»L/孔~37。(2孵育30minf洗板一显色一酶标仪450nm读数测定，自动拟合曲线并计算AFP含量。❷1.4统计学分析❷用SPSS13.0进行数据整理和统计分析，P0.05),直线回归方程为:Y(TRFIA)=0.938X(ELISA)+0

5、.988,r=0.94,两法呈正相关。❷2.2精密度试验❷参照NCCLS的精密度评价方案[2],用时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫吸附法分别对高、中、低3个浓度(参考值分别为800ug/L,170ug/L,5ug/L)的AFP质控血清进行重复性试验。结果显示，两种方法都有较好的重复性，但时间分辨荧光免疫分析法的CV值明显小于酶联免疫吸附法，见表lo❷2.3线性分析❷取髙值混合血清作6点倍比稀释，各复测3次，以原倍血清测定值为标准按稀释倍数算得其理论值，与两种方法实际测定值比较进行线性分析，TRFIA回归方程为：Y二1.04X+7.26,r二0.96；ELISA回归方程为：Y二0.63X

6、+45.31,r=0.91oTRFIA在0.72〜1078ng/L范围内线性良好;ELISA在4.21~535ng/L范围内线性良好。时间分辨荧光免疫分析法比酶联免疫吸附法具有更宽的检测范围。❷3讨论❷时间分辨荧光免疫测定的基本原理是以總系元素镐(Eu)螯合物作为荧光标记物，利用这类荧光物质寿命长的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命總系螯合物的荧光，从而有效排除非特异性本底荧光的干扰而提高灵敏度。TRFIA法的固相技术，也是保持其灵敏度的一个重要因素，同时增强液在TRFIA中的作用特别重要，优质的增强液是提高检测灵敏度的另一个关键因素

7、，加入增强液后，可以使Eu3+从反应复合物中解离下来，游离的Eu3+同增强液中的另一种螯合剂形成一种胶态分子团，这种分子团在激发光的激发下能够发出强烈荧光，信号可以增强100万倍［3］。TRFIA法的批内、批间精密度均比ELISA法好，这可能是由于TRFIA法利用了具有独特荧光特性的總系元素及其螯合物为示踪物，几乎完全消除了背景荧光的干扰，且试剂稳定性好，因而检测重现性好；ELISA法检测影响因素较多，另外，ELISA法定量AFP试剂盒的线性及