hurat1基因真核表达重组体的构建及意义

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1、hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义【摘要】目的构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体。方法提取人全血基因组DNA，进行PCR扩增，将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，应用核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1958bp的基因片段。该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定，证实hURAT1片段插入序列和方向正

2、确。结论hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的序列和方向正确，可用于后续基因功能研究，尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究。【关键词】人尿酸盐转运子1；pcDNA3.1(-)；基因；克隆，分子；内含子；高尿酸血症［ABSTRACT］ObjectiveToconstructtherebinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(-)/hURAT1.MethodsTotalgenomeDNAnormalhumantotalblood.DNAplificat

3、ion.PCRproductedintoDH5αEcoli.ConstructedpcDNA3.1(-)/hURAT1edigestionanalysisandDNAsequencing.ResultsA1958bpfragment,includingexon2tointron5ofhURAT1genomeDNA,plification.BamHⅠandEcoRⅠrestrictionenzymedigestionandDNAsequencingconfirmedentofhURAT1utationfunctionres

4、earchintheCDSorintron.［KEYTEasyVector(PROMEGA公司)、T4DNA连接酶（PROMEGA公司）、胰蛋白胨（SANGON公司）、酵母提取物（SANGON公司）、琼脂（SANGON公司）、氨苄青霉素（SANGON公司）、限制性内切酶（FERMENTAS公司）、pcDNA3.1(-)Vector(INVITROGEN公司)、DH5α感受态细胞（TIANGEN公司）、质粒小规模抽提试剂盒（AXYGEN公司）、质粒中规模抽提试剂盒（QIAGEN公司）。PTC225型高通量PCR仪（M

5、JR公司）、UVP凝胶成像仪（BIORAD公司）、MIR262恒温孵箱（SANYO公司）、低温离心机（EPPENDORF公司）、BioRAD电泳仪（BIORAD公司）、DU650型紫外线分光光度计（EPPENDORF公司）、超净工作台(ClassBiologicalSafetyCabiⅡ，BAKER公司)。1.2PCR扩增按照基因组DNA提取试剂盒说明提取正常人全血DNA。以GeneBank公布的hURAT1基因组DNA序列为模板，并根据所要构建的表达载体要求在5′和3′端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，扩增包含

6、第2外显子至第5内含子在内的一段序列。所有引物由上海生工生物技术有限责任公司合成(见表1)。应用多重PCR方法，首先扩增片段①，使用1FBAMH和1R作为引物，扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，66℃退火40s，68℃延伸1min30s，35个循环；68℃终延伸10min。其次扩增片段②，使用2F和2RECOR引物，扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，68℃退火40s，68℃延伸50s，35个循环；68℃终延伸10min。最终以片段①和片段②PCR产物1∶1混合为模板，扩增目的片段，使用1F

7、BAMH和2RECOR引物，扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，64℃退火1min10s，68℃延伸2min，35个循环；68℃终延伸10min。琼脂糖凝胶电泳，紫外线凝胶检测仪检测结果。PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收，定量，分装，一20℃贮存。表1PCR扩增hURAT1基因组DNA片段引物引物名称引物序列1.3重组体的构建1.3.1pGEMTEasyVector/hURAT1重组体的构建①连接：将末端加入dATP的扩增片段与pGEMTEasyVector按照摩尔比3～8∶1于4℃下连接12h。②

8、转化：将上述连接反应产物5μL加入50μL的DH5α感受态菌液中，轻轻混匀，冰浴5～30min；42℃热休克30s。立即置冰浴中，加入2×YT培养基900μL，然后37℃水平振摇培养45min(150r/min)；取适量的上述转化菌液涂布于预热的2×YT培养板(含氨苄青霉素100mg/L)；37℃水平培养过夜。③筛选