hurat1基因5’utr区荧光素酶表达重组体的构建论文

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1、hURAT1基因5’UTR区荧光素酶表达重组体的构建论文刘贤贤,李长贵,王瑶,吕森森刘贤贤【摘要】目的构建人尿酸盐转运蛋白1（hURAT1）基因5’UTR区荧光素酶表达重组体。方法PCR扩增包含hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段，克隆至荧光素酶表达载体pGL3basic，构建hURAT15’UTR区表达重组体。重组体经双酶切后测序进行鉴定。结果克隆获得的590bp的DNA序列与GenBank报道的一致，且插入方向正确。结论成功构建了含hURAT1基因5’UTR区的荧光素酶表达载体，可用于后续功能研究。【关键词】人尿酸盐转

2、运蛋白1；荧光素酶；高尿酸血症［ABSTRACT］ObjectiveToconstructtheluciferaseexpressionrebinantcontaininghumanuratetransporter1gene(hURAT1)in5’untranslatedregion(5’UTR).MethodsThesmallestfunctionalunitofhURAT1genepromoterandDNAsegmentsin5’UTRplifiedangenomeDNAbyPCR,thesegmentent(590bp)obtainedinthe

3、rebinantsentinsertedinthecorrectdirection.ConclusionTheluciferaseexpressionrebinantcontaininghURAT1in5’UTRissuccessfullyconstructed,anuratetransportprotein1；luciferase；hyperuricaemia原发性高尿酸血症及痛风为一种常见病和多发病。研究已经证实，90%以上原发性高尿酸血症是因肾脏对尿酸的排泄减少所致12，人近曲小管上皮细胞膜上多个转运蛋白参与了肾脏对尿酸的排泄，其中人尿酸盐转运子

4、1(hURAT1)是维持血尿酸水平的关键离子通道.freelRNA主要在人肾小管上皮细胞中特异性表达，临床上得到含有待研究SNP位点肾脏标本的概率很小，所以体外重组体的成功构建成为研究hURAT1基因突变或SNP影响基因启动子活性及其表达的主要手段。本文通过PCR技术扩增hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段，克隆到真核表达载体pGL3basic中，构建pGL3basic／hURAT15’UTR重组体，为今后研究该段区域基因变异对表达的影响奠定基础。1材料和方法1.1实验材料主要实验材料包括：基因组DNA提取试剂盒（TAK

5、ARA）、KODDNA聚合酶（TOYABO）、QIAquickGelExtractionKit（QIAGEN）、pGEMTEasyVector(PROMEGA)、T4DNA连接酶（PROMEGA）、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂、氨苄青霉素（SANGON）、限制性内切酶（FERMENTAS）、pGL3basicvector(INVITROGEN)、DH5α感受态细胞（TIANGEN）、质粒小规模抽提试剂盒（AXYGEN）。仪器：PTC225型高通量PCR仪（MJR）、UVP凝胶成像仪（BIORAD）、MIR262恒温孵箱（SANYO）、低温离心机（EP

6、PENDORF）、BioRAD电泳仪、DU650型紫线外分光光度计（EPPENDORF）、超净工作台(ClassBiologicalSafetyCabiⅡ，BAKERpany)。1.2实验方法1.2.1引物及其合成根据hURT1基因5’UTR区590bpDNA序列(-253～+337GenBankuc001oam.1)设计特异性引物，5′端分别加入KpnⅠ、BglⅡ酶切位点，上游引物为PF：5′GGGGTACCTTGGCTCAGCCACTCTG3′，下游引物为PR：5′GAAGATCTGGAACCTACTCAAGGGGC3′，由上海生工生物技

7、术有限公司合成。1.2.2基因组DNA的提取用酚氯仿抽提外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板。1.2.3PCR扩增用PF和PR引物，PCR扩增hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区在内的DNA片段（图1）。PCR反应参数：95℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸40s，进行35个循环；72℃延伸10min。15g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线凝胶检测仪检测结果。PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收,定量，分装，-20℃贮存。1.2.4pGEMTEasyVector/hURAT15’UTR重组体的构建①连接：4

8、℃将扩增片段与pGEMTEasyVector按照摩尔比（3～8）∶1连接12h