hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义.doc

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1、hURATl基因真核表达重组体的构建及意义【摘耍】目的构建pcDNA3.l(-)/hURATl真核表达重组体。方法提取人全血基因组DNA,进行PCR扩增，将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(_)连接后转化DH5a感受态细胞。重组质粒经BaraHI和EcoRI酶切后，应用核廿酸序列测定方法进行鉴定。结果PCR扩增得到hURATl第2外显子至第5内含子长1958bp的基因片段。该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接厉转化DH5a感受态细胞。重组质粒经酶切和核营酸序列测定方法鉴定，证实hURATl片段插入序列和方向正确。结论hURATl基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNAS.

2、1㈠的序列和方向止确，可用于后续基因功能研究，尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究。【关键词】人尿酸盐转运子l;pcDNA3.1(-)；基因；克隆，分子；内含子；高尿酸血•症[ABSTRACT]ObjectiveToconstructtherecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.l(-)/liURATl.MethodsTotalgenomeDNAwaspreparedfromnonrialhumantotalblood.DNAwasthensubjectedtoPCRamplification.PCRproductwasclonedin

3、topcDNA3.l(-)andthentherecombinantvectortransformedintoDH5aEcoli.ConstmctcdpcDNA3.l(-)/hURATlwasidentifiedbyrestrictingcnzymedigestionanalysisandDNAsequencing.ResultsA1958bpfragment,includingexon2tointron5ofhURATlgenomeDNA,wasobtainedbyPCRamplification.BamHIandEcoRIrestrictionenzymedigestionandDN

4、Asequencingconfirmedwiththecoircctsequenceanddirection.ThepcDNA3.l(-)/hURATlhadbeensuccessfullyconstructed.ConclusionThefragmentofhURATlwithcorrectsequenceanddirectionisclonedintotheeukaiyoticexpressionvectorpcDNA3.l(-),anditcanbeappliedtogenefunctionresearchinthefuture,especiallytothemutationfun

5、ctionresearchintheCDSorintron.[KEYWORDS]hURATl;pcDNA3.l(-);Gene;Cloning,molecular;Introns;Hyperuricemia人尿酸盐转运子1(hURATl)是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原发性高尿酸血症和病风的重耍候选基因，其基因变异与原发性高尿酸血症和痛风发病密切相关[1]。其基因位于llql3,含有10个外显子和9个内含子，cDNA全长2642bp,编码区长1659bp,编码555个氨基酸[2]。PubmedSNP检索结果显示，大多数SNP位点位于第2外显子与第5内含子之间，共78个，其屮相当数量S

6、NP位点位于内含子区域，而且与尿酸代谢异常高度相关[2-5]o然rfu,国内外相关研究均为关联性研究和基因编码序列的功能研究，缺乏内含子功能研究。hURATlmRNA主要在人肾小管上皮细胞屮特异性表达，临床上得到含有待研究SNP位点肾脏标本的概率很小，所以体外重组体的构建及其在真核细胞屮的表达成为研究hURATl基因突变或SNP影响基因转录或翻译的上耍手段。本文应用PCR方法对hURATl第2外显子至第5内含子之间基因纽.DNA序列进行扩增，然厉克隆到真核表达载体pcDNA3.1㈠，构建pcDNA3.1H/hURATl^组体，为今厉研究该基因变异对表达的影响奠定基础，从而可以进一步解解h

7、URATl与尿酸代谢异常之间的关系。1材料与方法L1主要试剂和仪器基因组DNA提取试剂盒（TAKARA公司）、KODDNA聚合酶（TOYAEO公司）、QIAquickGelExtractionKit（QIAGEN公司）、pGKMTEasyVector（PROMEGA公司）、T4DNA连接酶（PROMEGA公司）、胰蛋白陈（SANGON公司）、酵母提取物（SANGON公司）、琼脂（SANGON公司）、氨节青霉索（SANGON公司）、限