hurat1基因5’utr区荧光素酶表达重组体的构建

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1、hURAT1基因5’UTR区荧光素酶表达重组体的构建：刘贤贤,李长贵,王瑶,吕森森刘贤贤【摘要】目的构建人尿酸盐转运蛋白1（hURAT1）基因5’UTR区荧光素酶表达重组体。方法PCR扩增包含hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段，克隆至荧光素酶表达载体pGL3basic，构建hURAT15’UTR区表达重组体。重组体经双酶切后测序进行鉴定。结果克隆获得的590bp的DNA序列与GenBank报道的一致，且插入方向正确。结论成功构建了含hURAT1基因5’UTR区的荧光素酶表达载

2、体，可用于后续功能研究。【关键词】人尿酸盐转运蛋白1；荧光素酶；高尿酸血症　　［ABSTRACT］ObjectiveToconstructtheluciferaseexpressionrebinantcontaininghumanuratetransporter1gene(hURAT1)in5’untranslatedregion(5’UTR).MethodsThesmallestfunctionalunitofhURAT1genepromoterandDNAsegmentsin5’UTRplifiedang

3、enomeDNAbyPCR,thesegmentent(590bp)obtainedintherebinantsentinsertedinthecorrectdirection.ConclusionTheluciferaseexpressionrebinantcontaininghURAT1in5’UTRissuccessfullyconstructed,anuratetransportprotein1；luciferase；hyperuricaemia　　原发性高尿酸血症及痛风为一种常见病和多发病。研究已经

4、证实，90%以上原发性高尿酸血症是因肾脏对尿酸的排泄减少所致[12]，人近曲小管上皮细胞膜上多个转运蛋白参与了肾脏对尿酸的排泄，其中人尿酸盐转运子1(hURAT1)是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原发性高尿酸血症和痛风的重要候选基因[34]。hURAT1基因位于11q13区，其含有10个外显子和9个内含子，cDNA全长为2642bp，编码区长为1659bp，编码555个氨基酸[5]。5’UTR为连接第一外显子和启动子区的非编码序列，该区域在基因转录和翻译过程中发挥重要的调控作用，其SNP可明显影响启动子

5、活性，影响基因表达。hURAT1mRNA主要在人肾小管上皮细胞中特异性表达，临床上得到含有待研究SNP位点肾脏标本的概率很小，所以体外重组体的成功构建成为研究hURAT1基因突变或SNP影响基因启动子活性及其表达的主要手段。本文通过PCR技术扩增hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段，克隆到真核表达载体pGL3basic中，构建pGL3basic／hURAT15’UTR重组体，为今后研究该段区域基因变异对表达的影响奠定基础。　　1材料和方法　　1.1实验材料　　主要实验材料包括

6、：基因组DNA提取试剂盒（TAKARA）、KODDNA聚合酶（TOYABO）、QIAquickGelExtractionKit（QIAGEN）、pGEMTEasyVector(PROMEGA)、T4DNA连接酶（PROMEGA）、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂、氨苄青霉素（SANGON）、限制性内切酶（FERMENTAS）、pGL3basicvector(INVITROGEN)、DH5α感受态细胞（TIANGEN）、质粒小规模抽提试剂盒（AXYGEN）。仪器：PTC225型高通量PCR仪（MJR）、UVP凝

7、胶成像仪（BIORAD）、MIR262恒温孵箱（SANYO）、低温离心机（EPPENDORF）、BioRAD电泳仪、DU650型紫线外分光光度计（EPPENDORF）、超净工作台(ClassBiologicalSafetyCabiⅡ，BAKERpany)。　　1.2实验方法　　1.2.1引物及其合成　　根据hURT1基因5’UTR区590bpDNA序列(-253～+337GenBankuc001oam.1)设计特异性引物，5′端分别加入KpnⅠ、BglⅡ酶切位点，上游引物为PF：5′GGGGTACCTT

8、GGCTCAGCCACTCTG3′，下游引物为PR：5′GAAGATCTGGAACCTACTCAAGGGGC3′，由上海生工生物技术有限公司合成。　　1.2.2基因组DNA的提取　　用酚氯仿抽提外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板。　　1.2.3PCR扩增　　用PF和PR引物，PCR扩增hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区在内的DNA片段（图1）。PCR反应参数：95℃预变性