青海弧菌荧光素酶基因重组菌的构建与初步应用.pdf

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1、１〇〇６〇！６－國Ｑ７８６论文骗号中图分类号６１０．１０２日密级学科分类号义和《＊夫学ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ■硕±学位论义Ｉｋｉｄｂｂｉ山ＷｉＢｉＳｌｉｙ青海弧菌焚光素酶基因重组菌的构建与初步应用ＣｏｎｓＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｙａｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉ打ａ打ｔｂａｃｔｅｒｉａｓｐｐ］ＬｕｃｉｆｃｒａｓｅｅｎｅｓｆｒｏｍＶｌｂｒｋｉ立ｇ麵画ｓ－６７ｇｈＰ．Ｑ＾Ｍ１ｎｔｆ＾製环境科学与工程－ｒａｍＥＳｉ—ｉｆｃ—＞Ｍ

2、■ｉｊ■ｊｉ环境科学与工程罗爱红巧巧高志贤—天津理工大学研究生院二〇六年一月Ｉ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究：！：作和取得的研究成果，除了文中特别加标注和致谢之处外，论文中不包含其他人Ｂ经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我＾巧Ｘ作的同志对本研巧所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签字日期／学位论文作者签名：來江：知；＾年＾月／日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全丫解天津理工大学有关保留、使用学位

3、レ＞ｌ论文的规定。特授权天津理工大学可：将学位论文的全部或部，并采用影分内容编入有关数据库进行检索印、缩印或扫描等复制手，供查阅和借段交论保存文、的汇复编本和阅。同意学校向国家巧关部口或机构送电子文件。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签、名：多导师签名渗舞ｆ鲁＾签字日期：知４年：？月／曰签字Ｈ期：年月日５／分类号：610.1020密级：天津理工大学研究生学位论文青海弧菌荧光素酶基因重组菌的构建与初步应用（申请硕士学位）学科专业：环境科学与工程研究方向：水质毒性检测作者姓名：罗爱红指导教师：冯炘、高志贤2016年2月ThesisS

4、ubmittedtoTianjinUniversityofTechnologyfortheMaster’sDegreeConstructionandPreliminaryapplicationofrecombinantbacteriasofLuciferasegenesfromVibrioqinghaiensissp.-Q67ByAi-hongLuoSupervisorXinFeng,Zhi-xianGaoFebruary2016摘要本研究通过对比淡水发光细菌青海弧菌荧光素酶基因luxAB和luxCDABE在以pET-22b为载体以BL21（DE3）为宿主菌的表达体系中的表达，

5、为构建特异性检测毒性的重组菌提供基础。以青海弧菌基因组DNA为模板，设计引物扩增得到青海弧菌Q67荧光素酶基因luxAB和luxCDABE，将其分别与表达载体pET-22b连接，转化大肠杆菌DH5α测序，阳性质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。检测两种重组菌的发光特性，通过测定重组菌的相对发光强度（RLU）和OD600值可知：luxAB和luxCDABE重组菌都在癸醛和IPTG浓度均为1µL/mL培养基里培养第一个小时后达到最大RLU，值分别为750618.5和140901.5，luxAB重组菌相对发光强度更大，与已有研究结果不同。未添加癸醛作为发光底物的重组菌液均未检

6、测到发光强度，说明luxCDE基因在重组菌里没有得到表达，原因可能是该表达体系不适合其表达，也有可能是发光细菌本身的代谢产物阻碍了其表达。为了进一步验证青海弧菌荧光素酶基因在大肠杆菌中的表达效果并实现重组菌2+2+6+的初步应用，检测了重金属离子Cd、Hg、Cr对重组菌的毒性，通过计算相对发光强度进行直线拟合，计算得到EC50值（半有效浓度）分别为：luxAB重组菌：5.160、5.129、7.097mg/L；luxCDABE重组菌：6.137、7.643、7.736mg/L。在相同培养条件下，LuxAB重组菌比luxCDABE重组菌获得了更大的RLU，说明在本实验的体系中lu

7、xAB表达效果更好，luxAB重组菌检测重金属毒性得到了更低的EC50值进一步论证了这个观点。本实验实现了青海弧菌荧光素酶基因的表达，并成功地对其重组菌进行了初步应用，这为青海弧菌荧光素酶基因的应用提供了良好的基础。关键词：青海弧菌荧光素酶基因重组菌毒性测定AbstractThispapercomparetheexpressionandluminescnceofluxABandluxCDABEgenesfromVibrioqinghaiensissp.—Q67inEscherichiacol