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时间:2018-11-19
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1、hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义论文【摘要】目的构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体。方法提取人全血基因组DNA,进行PCR扩增,将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后,应用核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1958bp的基因片段。该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定,证实hURAT1片段插入序列和方向正确。结论hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.
2、1(-)的序列和方向正确,可用于后续基因功能研究,尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究。【关键词】人尿酸盐转运子1;pcDNA3.1(-);基因;克隆,分子;内含子;高尿酸血症[ABSTRACT]ObjectiveToconstructtherebinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(-)/hURAT1.MethodsTotalgenomeDNAnormalhumantotalblood.DNAplification.PCRproductedintoDH5αEcoli.ConstructedpcDNA3.1(-)/hURAT1edigestio
3、nanalysisandDNAsequencing.ResultsA1958bpfragment,includingexon2tointron5ofhURAT1genomeDNA,plification.BamHⅠandEcoRⅠrestrictionenzymedigestionandDNAsequencingconfirmedentofhURAT1utationfunctionresearchintheCDSorintron.[KEYTEasyVector(PROMEGA公司)、T4DNA连接酶(PROMEGA公司)、胰蛋白胨(SANGON公司)、酵母提取物(SANGON公司)、琼脂
4、(SANGON公司)、氨苄青霉素(SANGON公司)、限制性内切酶(FERMENTAS公司)、pcDNA3.1(-)Vector(INVITROGEN公司)、DH5α感受态细胞(TIANGEN公司)、质粒小规模抽提试剂盒(AXYGEN公司)、质粒中规模抽提试剂盒(QIAGEN公司)。PTC225型高通量PCR仪(MJR公司)、UVP凝胶成像仪(BIORAD公司)、MIR262恒温孵箱(SANYO公司)、低温离心机(EPPENDORF公司)、BioRAD电泳仪(BIORAD公司)、DU650型紫外线分光光度计(EPPENDORF公司)、超净工作台(ClassBiologicalSaf
5、etyCabiⅡ,BAKER公司)。1.2PCR扩增按照基因组DNA提取试剂盒说明提取正常人全血DNA。以GeneBank公布的hURAT1基因组DNA序列为模板,并根据所要构建的表达载体要求在5′和3′端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,扩增包含第2外显子至第5内含子在内的一段序列。所有引物由上海生工生物技术有限责任公司合成(见表1)。应用多重PCR方法,首先扩增片段①,使用1FBAMH和1R作为引物,扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性40s,66℃退火40s,68℃延伸1min30s,35个循环;68℃终延伸10min。其次扩增片段②,使用2F和2RECOR引物,扩增条件:9
6、4℃预变性5min;94℃变性40s,68℃退火40s,68℃延伸50s,35个循环;68℃终延伸10min。最终以片段①和片段②PCR产物1∶1混合为模板,扩增目的片段,使用1FBAMH和2RECOR引物,扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性40s,64℃退火1min10s,68℃延伸2min,35个循环;68℃终延伸10min。琼脂糖凝胶电泳,紫外线凝胶检测仪检测结果。PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收,定量,分装,一20℃贮存。表1PCR扩增hURAT1基因组DNA片段引物引物名称引物序列1.3重组体的构建1.3.1pGEMTEasyVector/hURAT1重组体的构建①
7、连接:将末端加入dATP的扩增片段与pGEMTEasyVector按照摩尔比3~8∶1于4℃下连接12h。②转化:将上述连接反应产物5μL加入50μL的DH5α感受态菌液中,轻轻混匀,冰浴5~30min;42℃热休克30s。立即置冰浴中,加入2×YT培养基900μL,然后37℃水平振摇培养45min(150r/min);取适量的上述转化菌液涂布于预热的2×YT培养板(含氨苄青霉素100mg/L);37℃水平培养过夜。③
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