tweak诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成mmp3的实验研究

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1、TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMP3的实验研究：夏丽萍,肖卫国*,李俊松,丁爽,鲁静【摘要】　　目的:通过观察TMP3的影响,探讨TMP3水平;用反转录聚合酶反应（RTPCR）检测FLS中MMP3mRNA的表达水平。结果:TMP3的水平明显高于对照组,具有显著的统计学意义（P<0.05）;TMP3mRNA表达水平为对照组的1.26倍,具有显著的统计学意义（P<0.05）;TNFα和IL1β对TMP3及MMP3mRNA表达具有协同作用,协同作用组

2、MMP3的水平及MMP3mRNA表达水平明显高于单纯TMP3,直接参与RA的关节损伤,TNFα和IL1β在此过程中发挥协同作用。【关键词】关节炎;类风湿;T:ToinvestigatetheeffectsofTMP3inRAFLSatdifferentconcentrationsandtodiscusstherelativemechanismofhoarilyculturedandstimulatedRNAexpressionofMMP3easuredbyRTPCR.RESULTS

3、:ThelevelofMMP3inducedbyTMP3.ThelevelinthesynergeticgrouppleTMP3inRAFLS.　　［Keyatoid;Tatrixmetalloproteinases3　　类风湿关节炎（rheumatoidarthritis,RA）是一种以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病,其病因及发病机制尚未完全明确。但大量研究证实:成纤维样滑膜细胞(fibroblastlikesynoviocytes,FLS)在RA发病过程中处于异常活跃

4、状态,分泌大量促炎性细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶,引发滑膜炎症反应、软骨基质的崩解［1］。肿瘤坏死因子样凋亡的微弱诱导剂(tumornecrosisfactorlikeornecrosisfactor,TNF)配体超家族的新成员,具有促进多种细胞因子分泌、诱导内皮细胞增生和血管生成等作用［2］,在RA的发生、发展中所起的核心作用备受关注［3］。本研究旨在通过观察TMP3的影响,探讨TMP3ELISA试剂盒购自RD公司。RTPCR试剂盒购自大连宝生物TaKaRa公司。　　1.2方法　　1.

5、2.1FLS的分离、鉴定、培养无菌获取关节镜术切除的RA患者滑膜组织,尽量剔除脂肪及纤维组织,无菌PBS冲洗2～3遍,反复剪切成细小组织块,置于无菌培养皿中,加入2g/L的胶原酶Ⅲ37℃消化24h,200目纱网过滤后,离心,去除脂肪及杂质,加入含100mL/L小牛血清(含青霉素、链霉素)的DMEM,分装于培养瓶内,置于37℃50mL/LCO2孵箱内培养24h后,更换培养液,待滑膜细胞80％汇合成片,按1∶3的比例消化传代,实验用3～7代细胞。FLS的鉴定采用流式细胞术测定CD14、CD68,免疫组

6、化法测定vimentin蛋白。CD14、CD68均阴性,vimentin蛋白免疫组化染色呈阳性,证实所分离的细胞为成纤维样滑膜细胞。　　1.2.2细胞因子刺激实验取处于对数生长期的FLS,经2.5g/L胰蛋白酶消化后,反复吹吸成单细胞悬液,调整细胞密度为2×108cell/L,接种于6孔细胞培养板,37℃贴壁培养24h后,弃掉培养液,用10mL/LFCSDMEM培养液同步化培养24h后,分别加入TMP3浓度检测采用双抗夹心ELISA法检测细胞培养液中MMP3的浓度,按试剂盒提供的说明操作。试

7、剂盒既可测proMMP3,又可测活化状态的MMP3。以所测标准品A值作为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据细胞培养液样品的A值在标准曲线上查出其浓度。　　1.2.4RNA的提取取加入TRIzol1mL冻存的FLS,经0.2mL氯仿处理后离心,上清用异丙醇沉淀,750mL/L乙醇洗涤沉淀物,弃乙醇,室温干燥后将沉淀溶于适量DEPC水中,核酸紫外分析仪检测,计算RNA纯度与浓度,-70℃冰箱保存。　　1.2.5反转录聚合酶链反应（RTPCR）cDNA合成采用反转录试剂盒,总体积为1

8、0μL:RNA模板1μL,25mmol/LMgCl22μL,10×RTBuffer1μL,10mmol/LdNTP1μL,反转录酶0.5μL,RNaseInhibitor0.25μL,Random9mers0.5μL,RNaseFreedH2O3.75μL。反应条件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。-20℃冰箱冻存以备PCR用。　　1.2.6PCR扩增MMP3引物（上游）5′ATGAAGAGTCTTCCAATCCTACTGT3′,（下游）5′