rai16蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用

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1、RAI16蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用：雒喜忠,王阁,许文,李琼,陈川,张志敏,胡庆,王东【摘要】目的:制备RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体,并进行初步鉴定和应用,为研究RAI16蛋白的功能及作用机制获得重要的实验工具。方法:应用Fmoc法化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽,经C18的RPHPLC纯化后,通过高碘酸钠法将纯化的RAI16蛋白的多肽与KLH交联;皮下注射抗原免疫新西兰纯种大耳白兔,加强免疫得到抗血清,应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、免疫组化、r)约为55000的RAI1

2、6蛋白。结论:所制备的多克隆抗体能与天然RAI16蛋白发生特异性反应,可应用于ELISA、免疫组化、免疫沉淀和ethylatedbovineserumalbumin(MBS)和福氏佐剂为Sigma公司产品。HiTrapTMProteinGHP抗体纯化柱为Amersham公司产品。羊抗兔IgGHRP和DAB为北京中杉金桥生物技术公司产品。ECL反应试剂盒为Amersham公司产品。SephadexTMG25脱盐柱(AmershamBiosciences,Soc方法,从C端向N端合成,获得的多肽经常规C18的RPHPLC柱进行纯化。纯

3、度为96%。RAI16与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法,将5mg合成肽加入7mgKLH和BSA中,边振荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液(1mL),室温作用2h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜,交联形成RAI16KLH、RAI16BSA偶联物。1.2.3RAI16蛋白合成肽抗体的制备取200μg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后,于兔颈部和背部皮下多点注射,每点约100μg。4周后加强免疫,剂量同前,用不完全福氏佐剂充分乳化后,于兔背部皮下多点注射;以后隔2周加强免疫1次;从第3次加强免疫开始,每次免疫

4、后7d,经耳中央动脉采血测定抗体的效价,经过4次加强免疫后符合要求时,立即颈动脉采血,分离血清后,无菌分装保存于-80℃备用。1.2.4ELISA检测抗血清效价用人脾脏微粒体蛋白和合成肽BSA偶联物以1mg/L的浓度包被ELISA检测板,每孔100μL,4℃孵育过夜后,用10mL/L胎牛血清封闭,37℃2h后,洗涤备用。取出包被好的检测板,每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100μL(对照为正常兔血清),37℃孵育30min,洗涤3次后每孔加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100μL,37℃孵育30min,洗涤3次后进行TM

5、B显色,37℃孵育15min,中止反应后,用酶标仪测定样品的A450的吸光值。1.2.5抗体血清的亲和纯化将获得的兔抗人RAI16多肽的抗体血清用结合缓冲液(100mmol/LTris/HC1,pH7.5,100mmol/LNaC1)稀释后,经0.45μm的滤膜过滤,加样到HiTrapTMProteinGHP的纯化柱上,用洗脱缓冲液(100mmol/L甘氨酸HCL,pH2.5)洗脱后,收集洗脱峰。1.2.6间接ELISA检测抗体相对亲和常数用合成肽交联BSA以1.5mg/L和1.0mg/L的浓度包被ELISA检测板,封闭后加入倍比稀释

6、的已知蛋白浓度的纯化后的抗体,再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗,TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标,A450值为纵坐标作图。以曲线达到水平时的A值为100%,求出A50即50%A值对应的抗体浓度。按照Kaff=(n-1)/2(n［Ab’］t-2［Ab］t)算出抗体亲和常数,其中［Ab’］t、［Ab］t指的是A50时即包被抗原为1.5mg/L和1.0mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度,［Ag］t、［Ag’］t指的是包被的抗原浓度本实验中即指15μg和10μg,n=［Ag］t/［Ag’］t,本实验中n=2。1.2.7多克隆

7、抗体的L/LNP40,150mmol/LNaCl,PBSpH7.2,2mmol/LEDTA,50mmol/L氟化钠,0.2mmol/L矾酸钠,蛋白酶抑制剂1∶50)裂解冰冻人脾脏组织样品,冰上孵育30min后,13500g离心45min,获得脾脏组织总蛋白,取5g总蛋白裂解液并加入等体积2×SDS加样缓冲液,于100℃加热5min后,进行常规SDSPAGE电泳,分离胶浓度为100g/L。电泳结束后,电转至PVDF膜上,用50g/L脱脂奶粉室温下封闭1h;然后加入1∶1000稀释的兔抗人RAI16蛋白N端多肽多抗,室温下孵育2h,TB

8、ST缓冲液洗膜后,加入羊抗兔IgGHRP抗体(1∶5000稀释),室温下孵育1h,TBST缓冲液洗膜后,ECL法显色。1.2.8RAI16在再生肝组织中表达的SF,pH7.4）,上清进行冷冻干燥24h,用