RAI16蛋白合成肽多克隆抗体制备及初步应用

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1、RAI16蛋白合成肽多克隆抗体制备及初步应用作者：雒喜忠，王阁，许文，李琼，陈川，张志敏,胡庆，王东【摘要】目的：制备RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体，并进行初步鉴定和应用，为研究RAI16蛋白的功能及作用机制获得重要的实验工具。方法：应用Fmoc法化学合成RAI16蛋白N端第44〜55位氨基酸的多肽，经C18的RPHPLC纯化后，通过高碘酸钠法将纯化的RAI16蛋白的多肽与KLH交联；皮下注射抗原免疫新西兰纯种大耳白兔，加强免疫得到抗血清，应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、免疫组化、Westernblot等初步鉴定和应用。结果

2、：化学合成RAI16蛋白N端第44〜55位氨基酸的多肽,纯化后多肽纯度为96%,达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联，用于免疫动物。经纯化后的抗体效价为1:125000o该多肽抗体可特异识别人脾脏组织中相对分子质量（MD约为55000的RAI16蛋白。结论：所制备的多克隆抗体能与天然RAI16蛋白发生特异性反应，可应用于ELISA、免疫组化、免疫沉淀和Westernblot等实验，为确定RAI16蛋白的组织分布和亚细胞定位、研究RAI16蛋白的功能及作用机制提供了重要的实验工具。【关键词】视黄酸诱导蛋白16；多肽抗原；多克隆抗体;ELISA；亲和层析近

3、几年在对视黄酸（RA）作用研究中发现了视黄酸诱导蛋白（RAI）系列基因，但尚无具体完整的结构和功能研究的相关报道，只是推测RAI系列蛋白可能是一种“新型”的胞内参与信号转导转录调控的蛋白质家族。视黄酸诱导蛋白16CRAI16）蛋白作为家族成员之一，了解其结构功能，对认识整个家族特征具有重要的意义。我们前期工作以Tec激酶结构域作为“钓饵”蛋白，利用酵母双杂交技术筛选构建于转录激活结构域（AD）载体的人胎肝cDNA文库，经营养缺陷选择及诱导筛选及初步鉴定,发现并确证了一个新的阳性克隆，对筛库所得基因片段测序经BLAST比对分析后，确定为RAI16（Hom

4、osapiensretinoicacidinduced16）基因,已被GenBank收录（编号为BC052237）,组织来源为脑IV型星状细胞瘤，其编码蛋白为RAI16o并由此推译出其蛋白质一级结构，对其功能区、信号肽、亚细胞定位、二级结构及亲疏水性等进行了分析。研究表明，RAI16蛋白是一种定位于胞质内内质网上的分泌型的球形信号蛋白，RAI16蛋白很可能在肝干细胞和肝癌诱导分化过程中，作为RA诱导蛋白被信号蛋白分子募集至胞质内，通过磷酸化、去磷酸化、豆蔻酰化、酰胺化等修饰，通过不同的活化形式和剪切方式以及胞质与胞核间的移位，完成其在信号转导中的重要角

5、色［1］。因此推测RAI16蛋白可能为RA信号通路中一类胞质内重要“新”的信号蛋白分子。结合前期工作，根据人RAI16蛋白的cDNA编码的氨基酸序列，结合计算机分子模拟设计11个氨基酸多肽,经与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫家兔制备多克隆抗体，并经亲和层析进行纯化。从而制备出可与天然RAI16蛋白发生特异性结合反应的抗RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体，为进一步深入研究RAI16蛋白的功能、阐明RAI16在肝癌细胞诱导分化信号转导通路中的作用和明确RAI16与Tec蛋白之间的相互作用机制作奠定了基础。1材料和方法1.1材料免疫和筛选用的RAI16蛋白

6、cDNA编码的氨基酸序列N端第44〜55位氨基酸的多肽为化学合成，免疫用抗原C端交联载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH),均由上海艾比玛特公司采用合成肽自动合成仪合成oMethylatedbovineserumalbumin(MBS)和福氏佐剂为Sigma公司产品。HiTrapTMProteinGHP抗体纯化柱为Amersham公司产品。羊抗兔IgGHRP和DAB为北京中杉金桥生物技术公司产品。ECL反应试剂盒为Amersham公司产品。SephadexTMG25脱盐柱(AmershamBiosciences,Sweden)、小牛血清、牛血清白蛋白、load

7、ingbuffer为TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司产品；免疫用兔子系新西兰纯种白兔2只(1.5个月左右，雄性健壮，质量为2000〜2200g),由上海申旺实验动物中心提供。1.2方法1.2.1RAI16合成肽的设计结合前期的研究，从GenBank中检索到RAI16蛋白cDNA全长序列，利用DNAstar软件根据抗原指数(AntigenicIndex)、亲水性结构(HydrophilicityPlot)、柔韧区(FlexibleRegions)及表面概率结构(SurfaceProbabilityPlot)4个参数及特异性、合成难易程度等方面综合分

8、析RAI16序列的特点，确定氨基酸片段为欲合成的肽序列，从N端起包含第44〜55位氨基酸，其序