rai16蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用

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1、RAI16蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用作者：雒喜忠,王阁,许文,李琼,陈川,张志敏,胡庆,王东【摘要】目的:制备RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体,并进行初步鉴定和应用,为研究RAI16蛋白的功能及作用机制获得重要的实验工具。方法:应用Fmoc法化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽,经C18的RPHPLC纯化后,通过高碘酸钠法将纯化的RAI16蛋白的多肽与KLH交联;皮下注射抗原免疫新西兰纯种大耳白兔,加强免疫得到抗血清,应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、免疫组化、Westernblot等初步鉴定和应用。结果:化学合成RAI16蛋白N端第44

2、～55位氨基酸的多肽,纯化后多肽纯度为96％,达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联,用于免疫动物。经纯化后的抗体效价为1∶125000。该多肽抗体可特异识别人脾脏组织中相对分子质量(Mr)约为55000的RAI16蛋白。结论:所制备的多克隆抗体能与天然RAI16蛋白发生特异性反应,可应用于ELISA、免疫组化、免疫沉淀和Westernblot等实验,为确定RAI16蛋白的组织分布和亚细胞定位、研究RAI16蛋白的功能及作用机制提供了重要的实验工具。【关键词】视黄酸诱导蛋白16;多肽抗原;多克隆抗体;ELISA;亲和层析12近几年在对视黄酸（RA）作用研究中发现了视黄酸诱导蛋白（RAI）系列

3、基因,但尚无具体完整的结构和功能研究的相关报道,只是推测RAI系列蛋白可能是一种“新型”的胞内参与信号转导转录调控的蛋白质家族。视黄酸诱导蛋白16（RAI16）蛋白作为家族成员之一,了解其结构功能,对认识整个家族特征具有重要的意义。我们前期工作以Tec激酶结构域作为“钓饵”蛋白,利用酵母双杂交技术筛选构建于转录激活结构域(AD)载体的人胎肝cDNA文库,经营养缺陷选择及诱导筛选及初步鉴定,发现并确证了一个新的阳性克隆,对筛库所得基因片段测序经BLAST比对分析后,确定为RAI16(Homosapiensretinoicacidinduced16)基因,已被GenBank收录(编号为BC05

4、2237),组织来源为脑Ⅳ型星状细胞瘤,其编码蛋白为RAI16。并由此推译出其蛋白质一级结构,对其功能区、信号肽、亚细胞定位、二级结构及亲疏水性等进行了分析。研究表明,RAI16蛋白是一种定位于胞质内内质网上的分泌型的球形信号蛋白,RAI16蛋白很可能在肝干细胞和肝癌诱导分化过程中,作为RA诱导蛋白被信号蛋白分子募集至胞质内,通过磷酸化、去磷酸化、豆蔻酰化、酰胺化等修饰,通过不同的活化形式和剪切方式以及胞质与胞核间的移位,完成其在信号转导中的重要角色［1］。因此推测RAI16蛋白可能为RA信号通路中一类胞质内重要“新”12的信号蛋白分子。结合前期工作,根据人RAI16蛋白的cDNA编码的氨

5、基酸序列,结合计算机分子模拟设计11个氨基酸多肽,经与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫家兔制备多克隆抗体,并经亲和层析进行纯化。从而制备出可与天然RAI16蛋白发生特异性结合反应的抗RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体,为进一步深入研究RAI16蛋白的功能、阐明RAI16在肝癌细胞诱导分化信号转导通路中的作用和明确RAI16与Tec蛋白之间的相互作用机制作奠定了基础。1材料和方法1.1材料免疫和筛选用的RAI16蛋白cDNA编码的氨基酸序列N端第44～55位氨基酸的多肽为化学合成,免疫用抗原C端交联载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH),均由上海艾比玛特公司采用合成肽自动合成仪合成。Methyla

6、tedbovineserumalbumin(MBS)和福氏佐剂为Sigma公司产品。HiTrapTMProteinGHP抗体纯化柱为Amersham公司产品。羊抗兔IgGHRP和DAB为北京中杉金桥生物技术公司产品。ECL反应试剂盒为Amersham公司产品。SephadexTMG25脱盐柱(AmershamBiosciences,Sweden)、小牛血清、牛血清白蛋白、loadingbuffer为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品;免疫用兔子系新西兰纯种白兔2只（1.5个月左右,雄性健壮,质量为2000～2200g）,由上海申旺实验动物中心提供。121．2方法1.2.1RAI

7、16合成肽的设计结合前期的研究,从GenBank中检索到RAI16蛋白cDNA全长序列,利用DNAstar软件根据抗原指数(AntigenicIndex)、亲水性结构(HydrophilicityPlot)、柔韧区(FlexibleRegions)及表面概率结构(SurfaceProbabilityPlot)4个参数及特异性、合成难易程度等方面综合分析RAI16序列的特点,确定氨基酸片段为欲合成的肽序列,从N端起包含第4