小鼠ska1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

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1、小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用【摘要】　　目的:制备兔抗鼠SKA1(SpindleandKinetochoreAssociated1)多克隆抗体。方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX2T原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG诱导表达GSTSKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Westernblot测定其特异性。结果:构建了pGEX2T　SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GSTSKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。EL

2、ISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1∶25600,Westernblot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性。通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中。结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础。【关键词】SKA1基因;纺锤体检测点;多克隆抗体;肿瘤;小鼠　　细胞分裂周期是一个严格调控、高度有序的过程,由细胞内固有的细胞周期检测点(cellcyclecheckpoints)来检查完成,以保证细胞复制的忠实性［1］。检测点功能缺陷可能会导致遗传基因突变和染色体结构异常的细胞获得增殖,10从而导致肿瘤

3、发生［2］。Sauer等［3］（2005）通过对处于有丝分裂期的人HeLa细胞的纺锤体（spindle）进行蛋白组学分析,发现了154个未知功能的蛋白,其中包括C18orf24(SKA1)。Hanisch等［4］研究发现人C18orf24(SKA1)与FAM33A(SKA2)形成蛋白复合物,功能性下调某些周期检测点激酶的表达,具有导致纺锤体检测点沉默（Spindlecheckpointsilencing）的作用。另外他们的研究还发现,SKA蛋白与MAD2附着于着丝粒的时候,存在着相反的条件要求。而其他研究表明［5］,在不同肿瘤细胞中确实存在着由于MAD2的突变,导致了纺锤体检测

4、点的功能缺陷。小鼠SKA1基因位于第18号染色体上,其cDNA长度为2500bp,最大开放阅读框（ORF）编码254个氨基酸,与人SKA1氨基酸序列（255个氨基酸）的同源性达到了75%,相似性达到了86%。然而目前对于SKA1在体内的作用的研究,尤其是在肿瘤发生发展中的分子效应机制方面了解甚少。因此本试验旨在制备SKA1多克隆抗体,为进一步的研究奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　E.coliDH5α,BL21菌株及质粒pGEX2T均由本实验室保存。TaqDNA聚合酶,SmaI限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Roche公司。质粒提取试剂盒、弗氏完全佐剂和弗氏不完全

5、佐剂购自Sigma公司。GlutathioneSepharose4B亲和层析柱和ProteinA10Sepharose购自GE公司。其他试剂购自CALBIOCHEM公司。雄性新西兰大耳白兔（2.5～3.0kg）购自加拿大西安大略大学动物中心（ACVS,UWO,CA）。　　1.2方法　　1.2.1重组质粒的构建　　以SKA1cDNA(InvitrogenecDNAcloneMGC:28070)为模板,以P1(5′GGGTTCCCGGGATGGACTCAGAGCTAGAAG3′)和P2(5′CGTCACTCCCGGGGCCTCAGG3′)为引物,PCR扩增SKA1的编码第125

6、4位氨基酸的SKA1片段。将经SmaI酶切PCR产物插入到同样用SmaI酶切的pGEX2T载体中,即得重组质粒pGEX2TSKA1。上述克隆所用PCR扩增条件为:94℃变性3min后,按以下参数进行30次循环:94℃变性30s,55℃复性1min,72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。PCR扩增所用酶为TaqDNA聚合酶。重组质粒经载体上的通用引物测序。　　1.2.2GST融合蛋白的诱导表达及纯化　　将重组质粒pGEX2TSKA1和表达GST的空载体pGEX2T转化到E.coliBL21中。37℃振荡过夜,再按2%的接种量转接,30℃培养6h后,加入IPTG至终

7、浓度为0.1mmol/L,20℃10继续诱导培养过夜。收集上述诱导菌,用GlutathioneSepharose4B小颗粒纯化GST融合蛋白,按GE公司提供的方法进行,即按10∶1(V/V)的比例加入细胞裂解液(50mmol/LTrisHCLpH7.5、150mmol/LNaCl、1mmol/LEDTA、0.3mmol/LDTT、10mL/LNP40及蛋白酶抑制剂),超声破碎,离心收集上清液,加入适量GlutathioneSepharose4B小颗粒,结合3h。再收集Glutathio