蛋白酶活化受体1单克隆抗体的制备与鉴定

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1、蛋白酶活化受体1单克隆抗体的制备与鉴定：马文静，何韶衡，周艳春，陈玉珍，黄阗，方泽漫，陈霖霏【摘要】目的制备蛋白酶活化受体1(PAR1)单克隆抗体(mAb)。方法以PAR1特异性片段为免疫原(13肽)免疫BALB/c小鼠，运用杂交瘤技术制备抗PAR1mAb。采用捕获酶联免疫吸附试验(captureELISA)鉴定mAb的Ig亚类；通过ELISA、Dotblot、免疫组化染色法、流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果获得2株可稳定分泌抗PAR1mAb的杂交瘤细胞，其亚型分别为IgM、IgG2b。免疫组化染色表明，mAb与人扁桃体

2、、结肠组织中的淋巴细胞、包皮组织中的成纤维细胞、肺组织中的巨噬细胞反应呈阳性。流式细胞仪分析显示，2株mAb与人肺腺癌细胞系A549细胞胞浆内及细胞膜上的PAR1均呈阳性反应。激光共聚焦扫描显微镜观察，荧光标记的阳性反应物在A549细胞胞浆内及细胞膜上均可见。结论成功地制备出抗PAR1mAb，为进一步研究炎症性疾病提供有用的试剂。【关键词】蛋白酶活化受体1；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验　　Productionandidentificationofmonoclonalantibodies　againstproteinaseactivatedreceptor

3、1　　ABSTRACT:ObjectiveToproduceandidentifyantiPAR1monoclonalantibodies.MethodsBALB/cmicemunizedinoacidpeptideofPAR1andhybridomacelllinesatechnology.ThespecificityofmAbselinkedimmunosorbentassay(ELISA),dotblot,immunohistochemicalstaining,floetry(FCM)andconfocallaserscanningmicros

4、copy(CLSM).ResultsTacelllinesthatsecretedmAbsagainstPAR1AbmunohistochemicalstainingrevealedthatthereactivitiesofmAbstothelymphocytecellsintonsilandcolontissues,tofibroblastcellsinforeskintissues,tomacrophagesinlungtissuesAbsreactedtoPAR1expressedbothonthemembranesurfaceandinthecyt

5、oplasmofA549cells.CLSMexaminationshoarkersembraneandinthecytoplasmofA549cells.ConclusionThemAbsagainstPAR1arepreparedsuccessfully,matorydiseases.　　KEYEM、HAT购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；PEGMerck公司；化学发光试剂盒购自Pierce公司；PE标记的大鼠抗小鼠IgM及PE标记的大鼠抗小鼠IgG2b抗体购自SouthernBiotech公司。　　1.4杂交瘤细胞的建立免疫动物：将1

6、g/L的PAR10.50mL与等体积的福氏完全佐剂混合并充分乳化后，皮下多点注射3只BALB/c小鼠。间隔3周进行第2次免疫，改用福氏不完全佐剂，抗原量及注射途径不变。3周后进行第3次免疫，抗原量及注射途径不变。融合前3d，经尾静脉注射0.20mL的抗原生理盐水溶液加强免疫1次。细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及克隆化，均按实验室常规进行。　　1.5mAb效价及Ig亚类的鉴定①效价测定：方法参照文献[1]。将杂交瘤细胞培养上清按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀释后用间接ELISA法测定A450值，以与靶抗原发生反应的mAb

7、的最大稀释度即为其效价。②Ig亚类的鉴定：用captureELISA法鉴定抗PAR1mAb的Ig亚类。方法如下，分别用抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM1∶1000稀释后取50μL包被检测板，室温放置3h；PBST冲洗3次后用30g/LBSA100μL封闭4℃过夜；PBST冲洗3次加待测上清50μL，阳性对照分别加入鼠源50μL1∶1000稀释的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM，阴性对照加50μLPBST，室温90min；PBST冲洗3次加polyantimouseIg,室温60min；PBST冲洗3次

8、显色。　　1.6mAb的特异性鉴定