临床医学毕业论文蛋白酶活化受体1单克隆抗体的制备与鉴定.doc

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1、XX大学毕业论文蛋白酶活化受体1单克隆抗体的制备与鉴定2014年6月25日蛋白酶活化受体1单克隆抗体的制备与鉴定作者：马文静，何韶衡，周艳春，陈玉珍，黄関，方泽漫，陈霖'霏【摘要】1=1的制备蛋白iW活化受体1(PAR1)单克隆抗体(mAb)o方法以PAR1特异性片段为免疫原(13肽)免疫BALB/c小鼠，运用杂交瘤技术制备抗PAR1mAb0采用捕获酶联免疫吸附试验(captureELISA)鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、Dotblot、免疫组化染色法、流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果获得2

2、株可稳定分泌抗PAR1mAb的杂交瘤细胞，其亚型分别为IgM、IgG2b。免疫组化染色表明，mAb与人扁桃体、结肠组织屮的淋巴细胞、包皮组织屮的成纤维细胞、肺组织屮的巨噬细胞反应呈阳性。流式细胞仪分析显示，2株mAb与人肺腺癌细胞系A549细胞胞浆内及细胞膜上的PAR1均呈阳性反应。激光共聚焦扫描显微镜观察，荧光标记的阳性反应物在A549细胞胞浆内及细胞膜上均可见。结论成功地制备出抗PAR1mAb,为进一步研究炎症性疾病提供有用的试剂。【关键词】蛋白酶活化受体1;单克隆抗体；酶联免疫吸附试验Productionandident

3、ificationofmonoclonalantibodiesagainstproteinaseactivatedreceptor1ABSTRACT:ObjectiveToproduceandidentifyantiPAR1monoclonalantibodies.MethodsBALB/cmicewereimmunizedwith13aminoacidpeptideofPAR1andhybridomacelllineswereobtainedbyhybridomatechnology.ThespecificityofmAbs

4、wascharacterizedbycaptureenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA),dotblot,immunohistochemicalstaining,flowcytometry(FCM)andconfocallaserscanningmicroscopy(CLSM).ResultsTwohybridomacelllinesthatsecretedmAbsagainstPAR1wereobtained.OnemAbwasIgM,andtheotherwasIgG2b.Immunoh

5、istochemicalstainingrevealedthatthereactivitiesofmAbstothelymphocytecellsintonsilandcolontissues,tofibroblastcellsinforeskintissues,tomacrophagesinlungtissueswereobserved.FCMshowedthatthe2mAbsreactedtoPAR1expressedbothonthemembranesurfaceandinthecytoplasmofA549cells

6、.CLSMexaminationshowedthatthefluorescentmarkerswerelocatedbothonthemembraneandinthecytoplasmofA549cells.ConclusionThemAbsagainstPAR1arepreparedsuccessfully,whichprovidesavaluabletoolforstudiesoninflammatorydiseases.KEYWORDS:proteinaseactivatedreceptor1;monoclonalant

7、ibodies;enzymelinkedimmunosorbsentassay蛋白酶活化受体1（proteinaseactivatedreceptor1,PAR1）是一，种蛋白质，由425个氨基酸组成，含7个疏水跨膜域，为典型的G蛋白偶联受体［1］。受体由细胞外区（N末端和细胞外禅）、跨膜区（7个跨膜螺旋）及细胞内区（细胞内禅和C末端）组成。C末端与受体脱散和信号转导有关；N末端有相应受体的蛋白酶裂解位点。在PA1的N末端，还有能够与凝血卿相互作用的水蛭索样序列。PAR1广泛分布在各种组织细胞上，包括上皮细胞、血小板、内皮细胞

8、、成纤维细胞、单核细胞、T淋巴细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、神经细胞、神经胶质细胞及某些癌细胞系等［23］o己知PAR1对丝氨酸蛋白酶有高选择性应答作用，这些酶包括凝血酶、纤溶酶、凝血因子Xa、激活蛋白CoPAR1结合并活化G蛋白触发级联反应，产生各种细胞效应：62+外流、整联