大鳞副泥鳅GPR30基因的克隆及EE2暴露对其表达的影响-论文.pdf

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1、第41卷第12期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vo1．41NO．122013年12月JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat．Sci．Ed．)Dec．2013网络出版时间：2013一Il一2i17：3O网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／61．1390．S．20131121．1730．030．html大鳞副泥鳅GPR30基因的克隆及EE2暴露对其表达的影响章霞，张莹莹，李蒙，郑尧，王在照(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100)[摘要]【目的】克隆大鳞副泥鳅(Pa

2、ramisgurnusdabryanus)G蛋白偶联受体30(Gprotein-coupledreceptor30)基因GPR30，研究其在成鱼各组织中的表达状况；用EE2(17a-ethynylestradi01)处理大鳞副泥鳅雌性幼鱼后，检测GPR30、ERmRNA在幼鱼肝脏和卵巢中的表达状况，探究EE2对雌激素膜受体GPR30和经典雌激素核受体ER基因表达的影响，推测GPR30可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT—PcR)和快速扩增cD—NA末端(RAcE)技术，克隆大鳞副泥鳅GPR30，对其核苷酸序列及所编码的氨基酸序列

3、信息和进化关系进行分析；采用实时荧光定量PCR(Rea1timePCR)方法，研究GPR30mRNA在大鳞副泥鳅成鱼性腺、肠道、肌肉、肾脏、脑、肝脏、鳃、眼睛等组织中的表达状况，以及经不同质量浓度(1，5，25ng／L)EE2处理后雌性幼鱼肝脏和卵巢中GPR30和ERamRNA的表达。【结果】克隆获得了GPR30，该基因全长2152bp，阅读框全长1062bp，编码353个氨基酸，该基因氨基酸序列与斑马鱼的GPR30氨基酸序列相似性最高，达92．9。GPR30氨基酸序列的比对结果显示，大鳞副泥鳅与其他脊椎动物的GPR30结构域一致。荧光定量PCR分析

4、表明，GPR30在大鳞副泥鳅成鱼卵巢中表达最高，在雄鱼肠道中表达最低，且GPR30mRNA在雌雄大鳞副泥鳅的性腺中差异性表达，在卵巢中的表达量较精巢中高702倍。EE2暴露试验显示，在5ng／LEE2处理组的卵巢及1和5ng／LEE2处理组的肝脏中，GPR30有略微增长；随着EE2质量浓度的增高，ERamRNA在肝脏中的相对表达水平较对照组显著增长。【结论】成功克隆了大鳞副泥鳅GPR30，其与哺乳动物的GPR30有相似的结构和功能，可能与雌激素效应存在密切关系。在基因转录水平上，GPR30与ER可能不存在直接的显著相关关系。[关键词]大鳞副泥鳅；GP

5、R30；基因克隆；实时荧光定量PCR[中图分类号]$917．4；Q78[文献标志码]A[文章编号]1671—9387(2013)12—0021—09CloningofGPR3OgeneandtheeffectsofEE2onitsmRNAexpressioninParamisgurnusdabryanusZHANGXia，ZHANGYing—ying，LIMeng，ZHENGYao，WANGZai—zhao(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaa

6、nxi712100，China)Abstract：【Objective]GPR30ofParamisgurnusdabryanus(Cobitidae，Cypriniformes)wasclonedanditsexpressionindifferentadulttissueswasexamined．ExpressionofERd(alsoknownasEsr1)andGPR30mRNAduringearlydevelopmentalstagesoffemaleP．dabryanusexposingtoEE2wasdetected．Thenwefocu

7、sedonareasonablespeculationbasedontheresultsaboutthefunctionsofGPR30．[Method]GPR30wasclonedbyreversetranscriptionPCRmethodandrapidamplificationcDNAends(RACE)method．TissuedistributionandtheexpressionlevelofGPR30mRNAwereanalyzedwithreal—timequanti～tativeRT—PCRmethod．Tissuestested

8、includedovary，testis，intestine，muscle，spleen，brain，liv