顺铂作用于耐顺铂卵巢上皮癌细胞后其细胞生物学特性的改变.pdf

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1、广西医科大学学报2013Feb：30(1)JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY7·33·顺铂作用于耐顺铂卵巢上皮癌细胞后其细胞生物学特性的改变石丽君于红静李力王琪△(广西医科大学附属肿瘤医院南宁530021)摘要目的：探讨耐顺铂卵巢癌SKOV3／DDPⅡ细胞对于顺铂作用后其细胞周期、凋亡、增殖及铂类耐药相关基因ARHGDIB和CCND1表达量的变化。方法：采用流式细胞术检测不同浓度和时间顺铂作用后SKOV3／DDPII细胞周期和凋亡率的变化，并与标记GFP的上皮性卵巢癌细胞株SKOV

2、3一GFP(敏感株)相比较；通过3-(4，5一二甲基噻唑一2)一2，5一二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测不同浓度和时间顺铂作用后细胞增殖的变化；实时荧光定量PCR(QRT—PCR)检测裸鼠体内瘤块耐药基因CC—ND1和ARHGDIB基因的表达情况。结果：半抑制浓度的顺铂作用48h后，SKOV3一GFP和SKOV3／DDP1I两株细胞分布于G。／G期的比例相对于无顺铂处理组明显下降(P

3、8h内SKOV3一GFP和SKOV3／DDPII两株细胞凋亡率随时间和浓度的增大而增大；以9．9，19．8，29．7“mol／L浓度的顺铂处理6d以后，SKOV3／DDP1I的增殖抑制得到解除，并继续生长，而SKOV3一GFP细胞则随顺铂作用时间延长增殖持续受到抑制。顺铂作用体内移植瘤5次后，CCND1在SKOV3／DDP1I一5的相对表达比sK0V3／DDPII一0增高92．98倍，作用第8次后，ARHGDIB在SKOV3／DDPⅡ一8的相对表达比SKOV3／DDPⅡ一0增高2．51倍。结论：具有耐药表型的卵巢

4、上皮癌细胞在顺铂作用下降低分布于G。／G期细胞数使细胞生长受到一定程度的抑制，但在顺铂刺激后肿瘤细胞过度表达CCND1基因使细胞J~il通过G／s检查点促进肿瘤细胞增殖，同时上调表达ARHGDIB基因抵抗顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡。关键词耐顺铂卵巢癌；顺铂；周期分布；增殖；凋亡中图分类号：R737．31文献标志码：A文章编号：1005—930X(2013)01—0033—05顺铂是卵巢癌一线的化疗药。对顺铂产生耐药性是影1．4细胞凋亡率测定：将SKOV3一GFP和SKOV3／DDPⅡ响卵巢癌以顺铂为主的联合化疗方案治

5、疗效果的一个重要细胞以每孔2x10个接种于6孔培养板。以浓度分别为原因。耐药的卵巢癌细胞是如何抵抗顺铂诱导的细胞凋9．9，19．8，29．7mol／L和39．6mol／L的顺铂处理各细胞，亡，其机制到目前为止还未完全清楚。因此，我们选用裸鼠于12，z4，36h和48h时收集细胞，上流式仪检测细胞的凋体内诱导的SK0V3／DDPⅡ耐药细胞株为模型，初步探讨卵亡率，方法按凋亡试剂盒(BDPharmingenAnnexinV：PE巢癌耐药细胞对顺铂作用的抵抗机制，为耐药逆转研究奠定ApoptosisDetectionK

6、itI)说明书进行，每处理3次重复。理论基础。1．5细胞增值检测：将SKOV3一GFP和sK0V3／DDPⅡ细胞以每孔1000个接种于96孔培养板。以浓度分别为9．9，1材料和方法19．8，29．7mol／L和39．6~mol／L的顺铂处理各细胞，对照组为DulcetMeaglemedia(DMEM)培养液，DDP作用24hI．1材料：sKOV3一GFP和sK0V3／DDPⅡ细胞株由本实验后换为普通DMEM培养液继续培养。DDP作用24h后(即室自建，顺铂为山东齐鲁制药有限公司生产，3-(4，5-二甲基顺铂作用后

7、第1天)，每孑L加入5g／L的MTT20L，继续培噻唑一2)-2，5-Z．苯基四氮唑溴盐(MTT)由济南翔科生物技术养4h后，弃上清，每孔加入100“L二甲基亚砜溶解，用酶标有限公司生产，细胞周期试剂盒(CycletestPlusDNARea—仪检测波长为540nm各孑L光密度值，以后每天检测1次，直gentKit)和凋亡试剂盒(AnnexinV：PEApoptosisDetection至加药后第9天。细胞的增殖率／抑制率一(当天所测吸光KitI)和Influx流式细胞仪均为美国BD产品。sYBR度一同一细胞前一

8、天所测得吸光度)／同一细胞前一天所测PremixExTaqII购自TAKARA公司，M—MLVReverse得吸光度×100％。Transcriptase由Promega公司提供。1．6QRT—PCR检测铂类耐药相关基因的表达：SKOV3一1．2实验动物：裸鼠(SPFBalB／C)由广西医科大学动物实GFP和sKOV3／DDPII细胞接种于裸鼠腹股沟皮下成瘤后，验中心提供