泥蚶血红蛋白的制备及其抗菌活性研究.pdf

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1、第３６卷第１２期海洋学报Ｖｏ．ｌ３６，Ｎｏ．１２２０１４年１２月ＡＣＴＡＯＣＥＡＮＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１４王素芳，包永波，施淼江，等．泥蚶血红蛋白的制备及其抗菌活性研究［Ｊ］．海洋学报，２０１４，３６（１２）：６７—７３，ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３-４１９３．２０１４．１２．００６WａｎｇＳｕｆａｎｇ，ＢａｏＹｏｎｇｂｏ，ＳｈｉMｉａｏｊｉａｎｇ，ｅｔａｌ．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｆｒｏｍTeg

2、illarcagranosa［Ｊ］．ＡｃｔａＯｃｅａｎｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ），２０１４，３６（１２）：６７—７３，ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３-４１９３．２０１４．１２．００６泥蚶血红蛋白的制备及其抗菌活性研究王素芳１，２，包永波２*，施淼江２，郑丹妮２，杨婷婷１，２，林志华２（１．宁波大学海洋学院，浙江宁波３１５２１１；２．浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室，浙江宁波３１５１００）摘要：利用凝胶层析技术从泥蚶血细胞裂解物中分离纯化得到两种血红蛋

3、白，回收率为７４．３％，并通过Ｔｒｉｃｉｎｅ-ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和质谱技术鉴定为Ｔｇ-ＨｂⅠ（同源二聚体）和Ｔｇ-ＨｂⅡ（异源四聚体）。分别通过琼脂扩散法和分光光度法测其抗菌活性和过氧化物酶活性，结果发现，两种Ｔｇ-Ｈｂ对大肠杆菌和恶臭假单胞杆菌均有抗菌活性，Ｔｇ-ＨｂⅡ对于恶臭假单胞菌和大肠杆菌的MＩＣ值分别为０．０６３ｍｇ／ｍＬ和０．１３ｍｇ／ｍＬ，Ｔｇ-ＨｂⅠ对两种菌的MＩＣ均为０．０４８ｍｇ／ｍＬ；两种Ｔｇ-Ｈｂ均具有过氧化物酶活性，能催化愈创木酚、邻苯二酚、对苯二酚、苯酚、左旋多巴等多种酚类物质。在Ｔｇ

4、-Ｈｂ中添加ＧＳＨ后，两种Ｔｇ-Ｈｂ均不再对恶臭假单胞杆菌具有抗菌活性。可见，两种Ｔｇ-Ｈｂ对恶臭假单胞杆菌等的抗菌活性均是通过其过氧化物酶活性发挥作用的。关键词：泥蚶；血红蛋白；抗菌活性；过氧化物酶活性中图分类号：Ｓ９４４．４＋４文献标志码：Ａ文章编号：０２５３-４１９３（２０１４）１２-００６７-０７道了脊椎动物Ｈｂ及其多肽片段的抗菌活性，关于无１引言脊椎动物Ｈｂ的抗菌活性的研究就更少。血红蛋白（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，Ｈｂ）是生物界分布最广的泥蚶Tegillarcagranosa隶属于软体动物门瓣一类呼吸蛋

5、白，主要在脊椎动物和部分无脊椎动物中鳃纲，是一种具有重要经济价值的海洋无脊椎动物，［１］存在。近十多年的研究发现，Ｈｂ除了具有运输和同时又是一类较特殊的含有Ｈｂ的双壳贝类。因其储存氧气的功能外，还具有调节ｐＨ值、控制体内一没有Ｔ细胞，缺乏真正意义上的抗体、没有类似脊氧化氮水平、参与免疫反应、运输硫化物、类卵黄蛋白椎动物的特异性免疫系统，因而只能依靠血细胞及［２—３］原以及调节浮力等多种生物学功能。尽管Ｈｂ体液因子的先天免疫反应来抵御外界环境中病原微是研究最多的一类呼吸蛋白，但以往的研究主要集中生物的入侵。因此，

6、进行泥蚶血红蛋白（Ｔｇ-Ｈｂ）的在其结构与携氧功能方面。直到近几年，受血蓝蛋白抗菌活性研究不仅有利于提高其自身的抗病能力，抗菌活性研究的启发，一些科学家才开始关注Ｈｂ的对于无脊椎动物免疫学的发展也具有重要的理论与［４—６］抗菌活性，Ｎｅａｊａｒ-Ａｒｒｏｕｍｅ等几位科学家先后报实践意义。收稿日期：２０１４-０１-１５；修订日期：２０１４-０３-２７。基金项目：国家８６３计划项目（２０１２ＡＡ１０Ａ４１０）；宁波市自然基金项目（２０１３Ａ６１０１６１）；浙江省教育厅高校科研项目（Ｙ２０１２２５９５１）；国家级大学

7、生创新创业训练计划项目（２０１３１０８７６０１８）；宁波市海洋贝类科技创新团队（２０１１Ｂ８２０１７）；水产科学浙江省重中之重学科开放基金项目。作者简介：王素芳（１９７７—），女，山东省单县人，博士，主要研究水产资源的开发与利用。Ｅ-ｍａｉｌ：２４２７４４１４＠ｑｑ．ｃｏｍ*通信作者：包永波，主要从事贝类功能基因和蛋白组研究。Ｅ-ｍａｉｌ：ｂｏｂｂａｏ２００１＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ６８海洋学报３６卷胶聚丙烯酰胺浓度为４％，分离胶浓度为１６％。电泳２材料与方法结束后，以考马斯亮蓝染色。２．１材料２．５琼脂扩散法测抑

8、菌活性２．１.１实验材料将对数生长期的细菌，用无菌生理盐水配制成泥蚶购自宁波市鄞州区东裕菜市场。金黄色葡５１０ｃｆｕ／ｍＬ的菌悬液，取２００μＬ均匀涂布在制好的萄球菌ＡＴＣＣ２９２１３、大肠杆菌ＡＴＣＣ３５２１８、恶臭假培养基上，放置牛津杯后依次加入２００生理盐水、μＬ单胞菌ＣＧMＣＣ１．０５９３、副溶血弧菌和哈维氏弧菌为ＨｂⅠ（１．５ｍｇ／ｍＬ）和ＨｂⅡ（２ｍｇ／ｍＬ）。金黄色葡萄球