泥蚶血红蛋白异源四聚体酶解多肽抗菌活性及其机理研究.pdf

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1、第３７卷第１２期海洋学报Ｖｏ．ｌ３７，Ｎｏ．１２２０１５年１２月ＨａｉｙａｎｇＸｕｅｂａｏＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１５王娟娟，包永波，王素芳，等．泥蚶血红蛋白异源四聚体酶解多肽抗菌活性及其机理研究［Ｊ］．海洋学报，２０１５，３７（１２）：１０６—１１５，ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３-４１９３．２０１５．１２．０１１ＷａｎｇＪｕａｎｊｕａｎ，ＢａｏＹｏｎｇｂｏ，ＷａｎｇＳｕｆａｎｇ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｄｅｒｉｖｅｄｐｏｌｙ-ｐｅ

2、ｐｔｉｄｅｆｒｏｍTegillarcagranosa［Ｊ］．ＨａｉｙａｎｇＸｕｅｂａｏ，２０１５，３７（１２）：１０６—１１５，ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３-４１９３．２０１５．１２．０１１泥蚶血红蛋白异源四聚体酶解多肽抗菌活性及其机理研究王娟娟１，２，包永波３，王素芳１，３，林志华３*（１．宁波大学海洋学院，浙江宁波３１５２１１；２．浙江海洋高效健康养殖协同创新中心，浙江宁波３１５２１１；３．浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室，浙江宁波３１５１００）摘要：采用凝胶层析技术从泥蚶血细胞裂解物中纯化得到两种血红蛋

3、白Ｔｇ-ＨｂⅡ（异源四聚体）和Ｔｇ-ＨｂⅠ（同源二聚体），回收率分别为４８．１５％和２４．９１％。胰蛋白酶酶解Ｔｇ-ＨｂⅡ，酶解液经反相Ｃ-１８色谱柱分离纯化得７种血红蛋白源多肽Ｆ１～Ｆ７。通过琼脂扩散法检测酶解多肽抑菌活性，结果发现７种多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌均无抑菌作用，但多肽Ｆ２～Ｆ７对副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌具有明显抗菌活性，且多肽Ｆ２～Ｆ７对副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌的ＭＩＣ值在０．０１２～０．２００ｍｇ／ｍＬ范围内。荧光显微镜观察酶解多肽杀菌效果发现多肽杀菌迅速，５ｍｉｎ内弧菌

4、细胞几乎全部死亡。利用透射电子显微镜观察正常的和经抗菌肽处理后的溶藻弧菌和哈维氏弧菌细胞的超微结构，结果显示，对照组正常细胞内部结构完整，而经抗菌肽处理过的细胞其细胞壁完整，但因缺乏细胞内容物支持导致局部区域内陷，细胞质膜明显收缩，细胞内物质外流形成许多空泡从而导致细胞死亡。研究结果表明血红蛋白源抗菌肽对泥蚶致病菌弧菌有明显的抗菌活性，其通过破坏细胞内部结构而起到杀菌作用，这些发现为血红蛋白抗菌机制的研究奠定了基础。关键词：泥蚶；酶解多肽；反相高效液相色谱；抗菌活性；超微结构；抗菌机理中图分类号：Ｓ９１７．４文献标志码：Ａ文章编号：０２５３-４１９３

5、（２０１５）１２-０１０６-１０发现，不仅从生物体内提取的某些多肽具有生物活１引言性，蛋白质经酶解处理后也会产生具有特殊功能的活［３］抗菌肽（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＭＰ）是一类具有性肽，Ｅｓｔｅｌｌｅ等研究发现，牛血红蛋白经酶解作用［１］抗菌活性的小分子蛋白质物质，广泛地分布在各类产生的某些肽段具有抗菌作用，而且肽段不同抗菌特［４］生物体内，是无脊椎动物、脊椎动物和植物等生物非性和活力也不同。赵玲等通过琼脂扩散抑菌试验［２］特异性免疫的关键因子。近年来，国内外相关研究发现南极磷虾酶解产生的多肽对金黄色葡萄球菌具收稿日期：２０１

6、５-０７-２０；修订日期：２０１５-０９-２８。基金项目：国家高技术研究发展计划项目（２０１２ＡＡ１０Ａ４１０）；浙江省自然科学重点基金项目（ＬZ１２Ｃ１９０００１）；浙江省重中之重学科开放基金项目（ＫＦ２０１４００２）；宁波市自然科学基金（２０１５Ａ６１０２５８）。作者简介：王娟娟（１９９０—），女，浙江省兰溪市人，主要从事海洋生物学研究。Ｅ-ｍａｉｌ：４２５１０７９４６＠ｑｑ．ｃｏｍ*通信作者：林志华，研究员，主要研究方向为水产动物繁育及遗传育种。Ｅ-ｍａｉｌ：ｚｈｉｈｕａ９９８８＠１２６．ｃｏｍ１２期王娟娟等：泥蚶血红蛋白异源四聚体酶解多肽抗菌

7、活性及其机理研究１０７［５］有较强的抑菌活性。抗菌肽因具有抗菌谱广泛、快（ＨZ-９２１１ＫＢ，江苏同君仪器科技有限公司），速查杀靶细胞、热稳定性好，特别是对靶菌株不易产ＮａｎｏＶｕｅｐｌｕｓ超微量紫外分光光度计（ＧＥ公司），生耐药性等优势，被认为是未来取代抗生素的上佳ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００高分辨液相色谱质谱联用系统（ＡＢ［６］选择。ＳＣＩＥＸ公司），荧光显微镜（ＮｉｋｏｎＥＣＬＩＰＳＥ８０ｉ，尼康泥蚶（Tegillarcagranosa），隶属于软体动物门公司），透射电子显微镜（Ｈ-７６５０，ＨＩＴＡＣＨＩ日立（Ｍｏｌｌｕｓｃａ），瓣鳃纲（Ｌａｍ

8、ｅｌｌｉｂｒａｎｃｈｉａ），是我国传统养公司）。殖贝类之一。因其体内富含特有的血红蛋白，味道鲜２．３泥蚶血红