苏中地区猪戊型肝炎病毒的检测及ORF2融合蛋白对SD大鼠的免疫保护性实验.pdf

《苏中地区猪戊型肝炎病毒的检测及ORF2融合蛋白对SD大鼠的免疫保护性实验.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、苏中地区猪戊型肝炎病毒的检测及ORF2融合蛋白对SD大鼠的免疫保护性实验DetectionoftheswineHEVinJiangsuprovinceandthefusionproteinofORF2immuneprotectiveexperimentsofSDrats硕士研究生：郭志导师：徐建生教授教育部创新团队项目江苏省高校优势学科建设工程项目扬州大学2014年6月中文摘要戊型肝炎∞patitisE，HE)是一种人畜共患疾病，由肝炎病毒科肝炎病毒属的戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)引起。一般在亚洲和非洲一些卫

2、生条件不发达的发展中国家和地区流行，而发达国家则呈散发，我国是主要流行国家之一。HEV可以感染多种动物，其中猪是自然界主要宿主，在跨种问感染和传播中起着重要作用。所以对猪戊型肝炎病毒的研究对于戊型肝炎的防治有着重要的意义。本研究首先应用逆转录．巢式聚合酶链法(R1二I】PcR)对当地某猪场的猪粪便标本和生猪屠宰中心的猪胆汁标本进行HEVRNA的检测，并对部分阳性标本进行克隆测序及阳性分析，以探讨猪戊型肝炎病毒在该地区的流行特点。结果显示采集的90份胆汁标本中，有4份HEV检测呈阳性，阳性率为4．44％。在140份猪粪便标本中，只有3～

3、4月龄的35份标本中检出3份HEVRNA阳性，阳性率为8．57％。其余月龄粪便标本中均未检出HEVRNA阳性。序列分析发现猪HEV相互之间在ORF2部分区域(nt6317～6466)的核苷酸序列的同源性为88．00／o～100．0％。与基因I、II、III和Ⅳ型的同源性为78．0～86．0％，81．3％82．7％，78．7％～84．0％，86．0％98．7％。因此猪戊肝病毒在该地区的存在且该猪源HEV属于基因Ⅳ型。然后利用Protean软件对猪戊型肝炎病毒(hepatitisEVkus，HEV)ORF2基因进行分析，选取4段抗原富集区

4、域，设计了4对套式RT-PCR引物分别扩增BE，BH，BW，和BZ区域的基因。然后将扩增得到将目的基因导入pGEX．6P．1表达载体中并在大肠杆菌BL21中诱导表达。结果显示只有两组重组质粒pGEX-BH和pGEX—BW成功表达出了大小分别为39ku和48ku的融合蛋白，而其他两组重组质粒pGEX．BE和pGEX—BZ则微量表达或不表达。将重组蛋白经变复性透析纯化后，Western-blotting分析表明大小为48ku的融合蛋白可与HEV阳性血清反应，表明该蛋白具有良好的反应原性。这个结果证明了猪HEW的天然免疫表位位于a．a．39

5、8～619之间，为HEV结构蛋白抗原表位的筛选及猪戊型肝炎病毒扬州大学硕士学位论文2血清学诊断的研究奠定了基础。最后根据相关文献报道SD大鼠可以作为戊型肝炎病毒感染的动物模型，所以研究三用融合蛋白GST-BW与弗氏佐剂等量混合后作为免疫原，按照0d、14d、28d的方案和200u∥只的剂量免疫3只SD大鼠。结果显示2只大鼠在第3周抗体转阳，另一只大鼠在4周后抗体转阳。免疫结束后以HEV悬液分别对试验组和对照组大鼠进行攻毒，结果发现对照组3只母鼠均出现血清转氨酶(ALT)升高，并且在攻毒3天后即可在粪便和血清中检测到HEVRNA，并且持

6、续排毒2周左右。试验组3只SD大鼠均未出现血清转氨酶(岫升高现象，仅在1只大鼠的粪便中检测出短暂排毒现象。然后取1份免疫组的SD大鼠血清(滴度l"．25600)和正常血清分别与HEV悬液混合过夜后感染2组正常SD大鼠，结果发现对照组2只大鼠出现ALT升高和持续排毒状况而抗体中和试验组2只大鼠未检测出粪便排毒和ALT升高现象。以上结果表明GST-BW融合蛋白对大鼠具有良好的免疫原性和免疫保护性，对防治动物之间的戊型肝炎病毒的传播和候选疫苗表位的筛选提供了相关基础的研究。关键词：猪戊型肝炎病毒：基因分析；克隆表达；免疫保护郭忐：苏中地区猪

7、戊型肝炎病毒的检测及ORF2融合蛋白对SD大鼠的免疫保护性实验3AbstractHepaititsE(HE)isazoonoticdisease，itiscausedbyhepatitisEvirus．HEoccurredOnbreakoutepidemicstageinAsiaandAfricawithpoorsanitationcondition,whereasonsporadicstageindevelopedcountries，ChinaisonoftheHE-epidemiccountryoftheworld．Various

8、animalsaresusceptibletoHE．Swineisorleofthemostimportantintermediatehostsandplayanimportantroleininterspeciestr