广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析

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1、分类号蔓墨丝：皓UDC——————硕士学位论文广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒0RF2的扩增和抗原性分析肖爱欢学科专业亟随兽医堂指导教师黄鱼坚数援赵武巫究员论文答辩日期2Q!Q：Q鱼：Q垒学位授予日期2Q!Q：Q鱼答辩委员会主席睦童趑婴究员论文评阅人扬威婴究虽郄到主推亡研究虽lIIIII／111111111111111]1111IlUllIIIlY1737720广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西

2、大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：勿肋年6月勿日，学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的

3、的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：，动即时发布口解密后发布(保密论文需注明，并在解密后遵守此规定)论文作一：彩么导师繇荔绎望2,汐／o车多月加日广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析摘要戊型肝炎(HepatitisE，HE)是由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEY)引起的消化道病毒性肝炎。大量的报道已经证实，HE在国内外均非常的盛行，人和多种动物对HEV均易感。广西为我国养猪大省，但对于猪群HE的调查及HEV的抗原性研究仍处于起步阶段，因此弄清广西猪戊

4、型肝炎的流行状况、猪源HEV与人源HEV在基因水平上的差异、HEV抗原表位的分布及抗原性基因的特征，对于戊型肝炎的防治、疫苗的研发都具有重大的意义。研究一，本研究通过RT-nested．PCR的方法对2009年07月至2010年03月从广西6个市县13个不同规模猪场采集的135份新鲜猪粪进行检测。结果显示135样品中有38份为HEVRNA阳性，阳性率为28．1％。在调查的13个猪场中，仅有一个猪场未检测到HEVRNA，猪场阳性率为92．3％。各猪场样品检出率在0．44．4％之间，13各猪场中有8个猪场感染率处于30．45％之

5、间。对13个猪场中各种年龄样品均能采集到的6个猪场的猪群进行感染率调查，67份不同月龄的样品中，O．30日龄HEVRNA阳性率为O％；31．60日龄阳性率为7．7％；61．90日龄HEVRNA阳性率为40％；91．120日龄HEVRNA阳性率最高，为58．8％；当猪群年龄超过120日龄后HEVRNA阳性率逐渐降低，阳性率为30．8％。结果显示2．4月龄为猪群的感染高峰期，32份样品中有16份样品为HEVRNA阳性，阳性率为50％。随机对24份阳性样品进行克隆，去除4份同源性为100％的分离株后得到20株同源性不一致的毒株。2

6、0株分离株间核苷酸同源性为91．2．99．7％。与基因型I型、II型、III型、Ⅳ型及禽HEV参考序列核苷酸同源性分别为：78．6．83．4％，75．9．77．9％，75．3．81．4％，83．4．97．7％，55．6．58．9％。20株分离株间氨基酸同源性为97．7．100％，其中13株氨基酸同源性为100％。与基因型I型、II型、ⅡI型、Ⅳ型及禽HEV参考株氨基酸同源性分别为：92．4．95．5％，93．1—93．9％，94．7．97％，97．7．100％，55．6．56．5％。通过用MEGA4．1软件Neighbor-

7、Joining中的P一距离法对20株分离株及各基因型参考株进行进化树构建与分析，结果显示所有的分离株均属于基因型Ⅳ型。在所有Ⅳ型序列中又可以分为6个亚型，本研究所有的分离株都分布在亚型b中。研究二，参考中国T1株序列设计巢式引物，从新鲜猪粪中扩增HEV部分基因片段，长为1725bp，位于HEVORF2205—1929bp之间，命名为HEVORF2．A。其后根据HEVORF2．A序列设计三对引物分别扩增HEVORF2．A三段连续的基因片段，命名为HEVORF2一B1、HEVORF2一B2、HEVORF2．B3，分别位于HEVO

8、RF2-A1-576bp，577—1149bp，1150-1725bp之间。将四段扩增的基因片段分别与表达载体PET32a(+)连接，转入BL21(DE3)plysS感受态细胞，IPTG进行蛋白诱导。经1mmol／L的IPTG在37。C诱导6小时后，除PET32a—A在82．6kd处有微量