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《独圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
0nlUIMIIIIlllllUllllIPUIY2359958CO-INFECTIONSBETWEENPORCINECIRCOVIRUSTYPE2ANDSWINEHEPATITISEVIRUSoFPIGSINJL～NGXIByHoujanHeSupervisor：Prof．Dr．ChengpingLuADISSERTATIONSubmittedtoNanjiangAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsForDoctorDegreeofAgronomy(VeterinaryMedicine)CompletedinApril2012CommencementinJune2012 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位敝作者c需亲笔，繇侮翰6月夕日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口√，在—L年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者(需亲笔)导师(需亲笔)签名：姗年多吵日v-,!z-每毛聂I7日 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．I』』旧≤；TRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．V符号及缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IX文献综述第一章猪圆环病毒2型分子生物学研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。11病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．1形态学和理化特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2分类地位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一32．1临床症状与病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．2宿主范围与传播方式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43病毒复制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一53．1基因组结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53．2复制模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54猪圆环病毒2型致病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64．1PCV对猪免疫系统的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64．2各种因素对PCV感染的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8参：考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11第二章猪戊型肝炎病毒研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一l2流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一32．1传染源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．2传播途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．3人群及动物的易感性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．4流行特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53戊型肝炎病毒感染的诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一63．1RT-PCR法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．2酶联免疫吸附实验(ELISA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73．3血清中和实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染3．4免疫荧光试验(IFA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯83．5免疫印迹(IB)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯83．6免疫电镜(IEM)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．83．7限制性内切酶消化法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯84戊型肝炎病毒的细胞培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一84．1原代细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯94．2二倍体细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯94．3传代细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯95猪戊型肝炎病毒的分子生物学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一95．1基因组特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯95。2编码蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ll5．3基因型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯146戊型肝炎病毒的疫苗研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯166．1大肠杆菌表达的重组蛋白或者抗原肽⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯166．2杆状病毒一昆虫细胞系统表达的重组蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯166．3酵母表达系统表达的重组蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一186．4转基因植物表达的重组蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．186．5重组腺病毒免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一186．6DNA免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯197猪戊型肝炎病毒的动物模型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯197．1非人灵长类动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．197．2家猪⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2l7．3啮齿动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～217．4其它动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23试验内容第三章PCR检测江西猪群猪圆环病毒2型感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．291材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．312．1不同区域来源的可疑病料PCV2感染的检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3l2．2不同区域来源的可疑病料PCV2亚型感染的检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一32 目录3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯371．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．371．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．381．3pUCm-T质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402序列的测定与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．423讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47第五章江西部分市县猪群猪戊型肝炎血清流行病学调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。491材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯501．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一501．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．512结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯542．1p166Mix抗原最适包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定⋯⋯⋯⋯⋯。542．2封闭液的选择及封闭时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一542．3血清稀释液的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一562．4阴阳性血清与包被抗原反应时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～562．5确定酶标二抗的作用时问⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一572．6问接ELISA方法阴阳性临界值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯582．7特异性反应试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．582．8应用本实验建立的问接ELISA测定血清样本HEVIgG结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯593讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61第六章江西部分市县猪群猪戊型肝炎病毒RNA的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯631材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯641．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．641．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．652结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯672．1猪粪中HEVRNA的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。672．2不同猪场及不同月龄猪粪样本的检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一682．3不同月龄段猪感染HEV的情况分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．69参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。70第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．731材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯741．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯741．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．742结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯752．14个HEV试验株ORF2348nt序列和基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯752．25个HEV试验株ORF2210nt序列和基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯772．313个江西SHEV试验株ORF2236nt序列和基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一783讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．793．1关于4个江西SHEV试验株ORF2348nt序列和基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯793．2关于5个江西SHEV试验株ORF2210nt序列和基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯803．3关于13个江西SHEV试验株ORF2236nt序列和基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯81参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82第八章猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒混合感染的检测与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯85l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯851．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．851．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．852结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯862．1血清和病料PCV2阳性检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一862．2血清和病料HEVRNA检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．862．3HEV与PCV2混合感染检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．863讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．87第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析⋯⋯891材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯901．1病料的收集与处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一901．2阳性病料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．901．3分子生物学试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一901．4检测PCV2和PRV的PCR方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯911．5检测PRRSV和HCV的RT-PCR方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9l2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯922．1扩增产物的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一92 目录2．2扩增片段的特异性鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯932．3检测结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯943小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯95参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．98全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1011i8；【谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．103 摘要猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染要与猪圆环病毒2型(PCV2)相关的一大类猪病统称为猪圆环病毒病(PCVD)或猪圆环病毒相关性疫病(PCVAD)。包括种猪繁殖障碍(SAMS)、断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)、生长肥育猪皮炎肾病综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)和肠炎等，同时也是猪呼吸道病综合征(PRDC)的原发病原之一，猪圆环病毒病给养猪业造成了巨大的经济损失。戊型肝炎病毒(HEV)是一种严重危害人畜健康的人畜共患病原，猪群感染猪戊型肝炎病毒常呈隐性过程，但在感染过程中可排毒污染环境，导致人戊型肝炎的发生。作者研究了江西猪群对PCV2及HEV混合感染的情况，以期为这两种病毒引起的疫病进．f-i-防控提供理论基础。1．PCR检测江西猪群PCV2感染参考GenBank已发表的PCV2基因序列，根据PCV2(AF027217)和PCVl(U49186)全基因序列设计合成一对引物进行PCR扩增，扩增出大小约1154bp的目的片段，建立了检测猪病料中的PCV2方法。采用该建立的PCR方法对2006年江西部分市县猪场的133份拟似病料进行PCV2检测，结果表明71份病料为PCV2阳性，阳性率为53．38％，证实江西省部分市县的猪场PCV2感染较普遍。PCV2亚型检测PCV2b阳性率为61．6％，PCV2a阳性率为4．5％，江西省猪群PCV2感染是以PCV2b为主。2．PCV2与HEV混合感染的检测与分析为了解PCV2型与HEV是否存在混合感染的情况，对90份病猪血清样品先进行PCV2检测，阳性58份，阳性率64．44％(58／90)；对这58份PCV2阳性的血清样品再进行HEVRNA的检测，阳性6份，阳性率6．67％(6／58)。136份疑似感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)先进行PCV2检测，阳性124份，阳性率91．18％(124／136)；再进行HEVRNA检测，阳性19份，阳性率13．97％(19／136)。结果证实PCV2与HEV 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染存在混合感染，疑似病料混合感染率13．24％(18／136)，疑似血清混合感染率6．67％(6／90)，平均混合感染率10．62％(24／226)。3．PCV2江西株的全基因序列分析根据已发表的PCV2的全基因组序列，设计一对特异性引物，进行PCR扩增，将1个扩增产物连接到pUCm—Tvector上，并克隆到大肠杆菌DH5a中，得到1个阳性克隆，经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定，证明扩增出了PCV2目的片段，本试验分离株(JXPCV2)与国内外不同地域的PCV2全基因组序列的差异很小，同源性在94．2％～99．7％；进化树分析表明JXPCV2与其他10个PCV2分离株的亲缘关系较近，与浙江分离株(AY691169)的亲缘关系最近。4．江西省部分市县猪群I-IEV血清流行病学调查为了解江西猪群HEV的感染情况，以7株(缅甸株p166Bur、墨西哥株p166Mex、美国株p166Us、中国株p166Chi、摩洛哥株p166Mor、巴基斯坦株p166Pak、新西兰株p166Nz)不同基因型的HEVORF2(编码中和抗原表位452～617aa)基因工程表达重组蛋白的等量混合物(p166Mix)作为包被抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG二抗作为酶标抗体，确定反应最佳条件，建立间接ELISA方法。用此方法对2005年来自江西猪群的430份血清样品进行HEVIgG抗体检测，其中商品猪(>6月龄)样品380份，349份呈阳性，阳性率为91．8％；3～5月龄猪样品20份，13份呈阳性，阳性率为65．O％；小于3月龄猪样品30份，10份呈阳性，阳性率为t33．3％。统计分析表明不同月龄猪HEV抗体阳性率差异极显著(P0．05)。5．江西部分市县猪群I-IEVRNA的检测为了解江西猪群HEV的感染情况，2005年采集江西省4个市县7个集约化猪场不同月龄猪粪样品271份，其中A猪场40份、B猪场40份、C猪场30份、D猪场43份、E猪场18份、F猪场49份和G猪场51份。利用逆转录套式PCR方法(RT-nPCR)，检测HEVRNA，结果表明A猪场阳性7份，阳性率17．5％；B猪场阳性10份，阳性率25．0％；C猪场阳性7份，阳性率23．33％；D猪场阳性11份，阳性率25．58％；E猪场阳性4份，阳性率22．22％；F猪场阳性7份，阳性率14．29％；G猪场阳性4份， 摘要阳性率7．84％：总阳性50份，总阳性率为18．45％。在271份样品中，0—1月龄31份，阳性3份，阳性率9．68％；l～2月龄24份，阳性7份，阳性率29．17％；2～3月龄116份，阳性27份，阳性率23．28％；3～4月龄17份，阳性3份，阳性率17．65％；4—5月龄25份，阳性3份，阳性率12．00％；5～6月龄26份，阳性4份，阳性率15．38％；大于6月龄32份，阳性3份，阳性率9．38％。6．江西猪群感染HEV的基因型分析为了解江西猪群感染HEV的基因型情况，对PCR扩增产物进行纯化并测序，利用分子生物学软件进行序列分析和进化树绘制，4个江西SHEV试验株ORF2348nt同源性为92．1％～97．5％，为同一基因型，与HEVl、HEV2、HEV3同源性分别为70．7％-,77．4％、72．5％75．7％和71．6％～76．8％，与HEV4型的同源性79．2‰83．9％。5个江西SHEV试验株ORF2210nt同源性为80．1％-97．7％，为同一基因型，与HEV3同源性为78．1％～82．8％，与HEV4型的同源性78．90／0-,95．9％；13个江西SHEV试验株ORF2236nt同源性为80．4％---100％，为同一基因型，与HEVl、HEV2、HEV3同源性分别为68．5％～76．4％、70．6％--82．3．％和74．5％～83．7％，与HEV4型的同源性76．9％90．8％。进化树进行分析表明22个试验毒株与HEV4型的代表株在同一分支上，属基因4型，表明江西猪群HEV感染以基因4型为主。7．临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和csFv-蹴染的检测与分析根据GenBank已发表的序列和参考有关文献，分别设计合成针对猪伪狂犬病病毒(PRV)gD基因和PCV2ORF2基因的特异性引物，建立检测这两种DNA病毒的多重PCR方法，可同时扩增出217bp和404bp相应目的片段。同时，分别设计合成针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因和猪瘟病毒(CSFV)E2区基因的特异性引物，建立检测这两种RNA病毒的多重RT-PCR方法，可同时扩增出372nt和375nt相应目的片段。应用建立的两种多重PCR方法，对来自江西猪群2006年7月至2007年12月期间的253份临床病料进行检测，结果显示PRRSV阳性215份，阳性率85．O％(215／253)；CSFV阳性143份，阳t}生率56．52％(143／253)；PCV2阳性93份，阳性率36．76％(93／253)；PRV阳性6份，阳性率2．37％(6／253)。PRRSV和CSFV双重感染103份，阳性率40．71％(103／253)；PRRSV和PCV2双重感染53份，阳性率20．95％(53／253)；PRRSV和PRV双重感染2份，阳性率0．79％；PCV2 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染和CSFV双重感染11份，阳性率4．35％(11／253)；PCV2和PRV双重感染1份，阳性率0．4％(1／253)。PRRSV、CSFV和PCV2三重感染26份，阳性率10．28％(26／253)；PRRSV、PCV2和PRV三重感染1份，阳性率0．4％(1／253)。PRRSV、CSFV、PCV2和PRV四重感染1份，阳性率0．4％(1／253)。关键词：猪圆环病毒2型；猪戊型肝炎病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；基因型；混合感染 ABSTRACTCo．INFECTIoNSBETWEENPoRCINECIRCoVIRUSTYPE2ANDSWINEHEl'ATITISEⅥRUSoFPIGSINJL～NGXIPorcinecircovirustype2(PCV一2)isacausutiveagentofporcinecircovirusdisease(PCVD)orporcinecircovirusassociateddisease(PCVAD)，includingSOWabortionandmortalitysyndrome(sAavIs)，postweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)，porcinedermatitisandnephropathysyndrome(PDNS)，proliferativeandnecrotizingpneumonia(PNP)，andenteritis．PCV2isoneoftheprimarypathogensofporcinerespiratorydiseasecomplex(PR_DC)．PCVDhascausedhugeeconomiclosstothepigindustry．HepatitisEvirus(HEY)isanetiologicalagentofhumanHepatitisE，anenterically—transmittedacuteviralhepatitis．SeveralspeciesofdomesticanimalhavebeenreportedasreservoirsofHEVofwhichdomesticpigsaremajorreservoirresponsibleforthezoonoticfood—bomtransmissionofHEVtohumans．Pigsinfected、析t11swineHEVusuallyshowsubclinicaldisease，butshedthevirus．TorevealtheprofileoftheCO—infectionofPCV2andHEVinJiangxipigs，andthustoprovideknowlegesforthepreventionandcontrolofthediseasescausedbythoseviruses，asurveywasperformed．1．DetectionofPCV2fromswineinJiangxiprovincebyPCRToestablishaPCRfordetectionofswinePCV2，apairofprimersWasdesignedbasedonthecompletegenomicsequencesofPCV2(accession#AF027217)andPCV1(accession#U49186)publishedinGenBank．TheexpectedPCRproductfromtheprimersetwasaround154bpinsizewhendetectedbyargrosegelelectrophoresis．Atotalof133specimenssampledfromdiseasedordeadpigsfromdifferentpigfarmsinJiangxiweretestedbytheestablishedPCRforPCV2．Ofwhich，71werePCV2positive(53．38％)．ThefindingsindicatedthatPCV2infectionsinJiangxipigswereverycommon．2-CompletegenomesequenceanalysisofPCV2OxPcv2)isolatedfromJiangxiAccordingtothepublishedcompletegenomesequencesofPCV2，apairofprimerswasdesignedtoamplifytheentiregenomesequenceofJXPCV2isolatedfromapigfarminJiangxi．ThePCRproductWaspurifiedusingcommercialkit．Afterwards，thepurifiedampliconwasclonedintopUCm—TvectorandthentransfectedintoEcoli．DH5a．TheV ABSlRACTrecombinationplasmidwasidentifiedbydigestionofdifferentrestrictionenzymesandPCR,andthensequenced．TheresultsofsequencinganalysesshowedthatJXPCV2sharedhigherhomology嘶tllthestrainsisolatedfromChinaandothercountries，whichwasrangedfrom94．2％一99．7％．PhylogenetictreeanalysisrevealedthatJXPCV2WaSclustered、忻thtenisolates．andmostcolselyrelatedtoZhengjiangisolate(accession撑AY69169)．3．DetectionandAnalysisofco-infectionsofHEVandPCV2ToelucidatetheCO—infectionsofHEVandPCV2inpigheardsinJiangxi，atotalnumberof90bloodsamplesfromdiseasedpigswereinitiallyexaminedforPCV2．Theresultsshowedthat58outof90specimens(64．44％)werePCV2posititive．Subsequently,these58PCV2DNAposititivespecimensweretestedforHEVRNAbyImPCR，andfound6in58wereHEVpositive，thatisa6．67％CO—infectionrate．Additionally,136tissuesamplestakenfromdiseasedpigsweredetectedforthepresenceofPCV2DNA，andtheresultsrevealedthat124in136werePCV2posititive，thatis，witllaPCV2positiverateasllighas91．18％．ThesespecimenswerethentestedforHEVRNA，theresultsshowedthat19outof136specimens(13．97％)wereswineHEVposititive．Tosummary,theresultsofthestudydemonstratedthattheCO—infectionratefromthetestedseraandtissue／organsampleswas6．67％and13．97％forswinePCV2andHEV,respectively,i．e．，a10．62％averageCO—infectionrate．4．Sero—epidemiologicalSurveyofSwineHepatitisEinsomecitiesandCountiesinJiangxiInordertodeterminetheprevalenceofswineHEVinfectioninJiangxipigherds，anindirectAb—captureELISAWasdevelopedandvalidated．SevenrecombinantproteinscodedbyORF2(452"--617aa,neutralizingAbepitope)fromdifferentgenotypesofHEV,includingBurmastrain(p166Bur)，Mexicanstrain(p166Mex)，USstrain(p166Us)，Chinastrain(p166Chi)，Morocoostrain(p166Mor)，Pakistanstrmn(p166Pak)andNew—Zealandstrain(p166Nz)，werepreparedandmixedwithallequalamount．Thismixturewasreferredtoasp166Mix，andusedaScoatingantigen．CommercialHRP．1abelledGoatAnti-porcineIgGservedasconjugate．Byutilizingthosereageents，aIlinderectAb—captuerELISAWasdevelopedandopitimized．Theserumspecimens(N=430)sampledfromdifferentpigfarmsinJiangxiweretestedbytheestablishedELISAforthedeterminationofthelevelofIgGantibodiesagainstHEV．ofwhich，380weretakenfrom>6month-oldpigs，20from3-5month—oldpigs，and30from<3month-oldpigs，respectively．TheresultsofELISArevealedthat349outof380(91．8％)，13outof20(65．O％)and10outof30(33．3％)VI ABSTRACTweresero-positiveforHEV．ItsuggestedthatswineHEVinfectionswereseriousindifferentpigfarmsinJiangxi，andthepositiverateofanti—HEVantibodywaspositivecorrelationwiththeageofswine．Statisticalanalysisdemonstratedthatthesero—positiverateWasnotrelatedtogeographicregionsQ>0．05)，buttherewasasignificantdifferenceamongages(P<0．01)．5．TheDetectionofSwineHepatitisERNAinsomecitiesandCountiesinJiangxiInordertoinvestigateHEVinfectionsofpigherdsinJiangxi，swinefaecalspecimens(N-271)werecollectedfrom7scalepigfarmsinJiangxi．Ofwhich，40frompigfarmA，40frompigfarmB，30frompigfarmC，43frompigfarmD，18frompigfarmE，49frompigfarmF，51frompigfarmGrespectively．ThesespecimensweretestedforthepresenceofHEVRNAbyareversenestedtranscriptionpolymerasechainreaction(RT-nPCR)．TheresultsfromRT-nPCRshowedthat50outof271specimenswereHEVpostitive，thatis，an18．45％totalpositiverate．TheHEVpositivespecimensforeachindividualpigfarmwereasfollows：pigfarmAwas7in40(17．5％)，pigfarmBWas10in40(25．O％)，pigfarmCWas7in30(23．33％)，pigfarmDWas11in43(25．58％)，pigfarmEWas4in18(22．22％)，pigfarmFwas7in49(14．29％)，pigfarmGwas4in51(7．84％)，respectively．Accordingtotheageofthepigs，thenumberofHEVpositivespecimensandpositiveratewereasfollows：0N1monthagewere3from31and9．68％，1-2monthagewere7from24and29．17％，2—3monthagewere27from116and23．28％，3--4monthagewere3from17and17．65％，4-5monthagewere3from25and12．00％，5-6monthagewere4from26and15．38％，morethan6monthsagewere3from32and9．38％，respectively．6．TheGenotypeanalysisofSwineHEVsinfectingpigherdsinJiangxiThePCRproductscoveringdifferentlocationsofORF2ofHEVwerepurifiedandsequenced，andthenthesequenceswereanalyzedbyDNAStarLasergenev8．0(DNASTAR，Inc．)．AphylogenetictreewasgeneratedbyMEGA4software．Theidentityof348ntnucleotidesequencesoffourswineHEVisolatesrangedfrom92．1％97．5％whencompared诵meachother,fallinginthesamegenotype．TheseswineHEVhad70．7％～77．4％，72．50,／o--75．5％，71．6％～76．8％，79．2％～83．7％nthomologtohumanHEVl，HEV2，HEV3，andHEV4，respectively．Theidentityofnucleotidesequencesof210ntfragrnemspcifietoORF2of5swineHEVisolatesrangedfrom80．1％to97．7％，fallingintothesamegenotype．TheseswineHEVshad78．1％N82．8％and78．9％-95．9％nthomologytohumanHEV3andHEV4．Likewise，Theidentityofnucleotidesequencesof236ntwithintheORF2of13swineHEVisolatesWas80．4．1o／o--100％，belongingtotheVII ABSTRACTsamegenotype，andtheyhad68．50／'旷76．4％，70．6％82．3％，74．5％--83．7％and76．9％-90．8％nthomologtohuman髓Vl，HEV2，艇V3，andHEV4，respectively．Phylogeneticanalysesfurtherrevealedthatthese17swineHEVisolateswerecloselyrelatedtoHEVT1strain，andbelongedtoHEVgenotype4，indicatingthatswineHEVsfromJiangxianalyzedinthisstudywerethesamegenotypecirculatinginotherareasandbelongedtoHEVgenotype4．7．DetectionandAnalysisofco-infectionsofPRRSV,CSFV,PCV2andPRVinclinicalspecimenssampledfrompigsinJiangxiToinvestgatetheco—infectionscausedbyPRRSV,CSFV,PCV2，andPRV,twomultiplexPCR／RT-PCRweredeveloped．Assayone，amultiplexPCR,WasfordetectingPRVandPCV2．neprimersweredesignedbasedonthesequenceofPRVgDandPCV2ORF2depositedinGenBank，andtheexpectedampliconswere217bpand403bp，respectively；assaytwo，amultiplexRT-PCR，WasfordetectingPRRSVandCSFVTheprimersweredesignedaccordingtothesequencesofPRRSVORF7andCSFVE2fromtheGenBank，andthepredictedPCRproductswere372ntand375nt，respectively．TheSpecificityandsensitivityofthismultiplexPCR瓜T-PCRweredetermined．Atotalof253ClinicalspecimensfromdifferentpigfarmsinJiangxiweretestedbytwomultiplexPCR／I弭PCRmentionedaboveforthepresenceofPRRSV,CSFV,PCV2．andPRV．Theresultsshowedthat215werePI汛SVpositive(85．O呦，I43wereCSFVpositive(56．52％)，93werePCV2positive(36．76％)and6werePRVpositive(2．37％)，respectively．OnehundredthreespecimenswerepositiveforbothPRRSV／CSFV、vi廿laco—infectionrateof40．71％；fiftythreespecimenswerepositiveforbothPCV2／PRRSVwithaco—infectionrateof20．95％；twospecimenswerepositiveforPRRSV／PRVwithaco．infectionrateofO．79％：elevenspecimenswerepositiveforPCV2／CSFVwithaco—infectionrateof4．35％；onespecimenwaspositiveforPCV2／PRVwithaco—infectionrateof0．40％：twentysixspecimenswerepositiveforPRRSV／CSFV／PCV2withaco．infectionrateof10．28％：onespecimenWaspositiveforPRRSV／PCV2／PRVwithaco．infectionrateof0．40％：andonespecimenWaspositiveforallfourpathogens(PRRSV／CSFV／PCV2／PRV)wit}laco．infectionrateof0．40％．KEYWORDS：Porcinecirvovirustype2；SwinehepatitisEvirus；Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；Genotype；Co—infectionVIII 符号及缩略语英文缩写PCV2(S)HEVPRRS(V)CSF(V)PR(V)PCRI弭PCRELISAr／rainOI疆肛ggLmmol／LDNTPSPDNSPRDCPWMSPBSEBEDTATAEbp英文全称Porcinecircovirus2(Swine)HepatitisEvirusPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(virus)Classicalswinefever(virus)PseudorabiesⅣ)PolymerasechainreactionReversetranscriptionpolymerasechainreactionEnzyme-linkedimmunosorbentassayRoundperminuteOpenreadingframemicrogrammicroliterMiUimole／1iterDeoxyribonucleosidetriphosphatesPorcinedermatitisandnephropathysyndromePorcinerespiratorydiseasecomplexPost．weaningmultisystemicwastingsyndromePhosphatebufferedsalineEtllidiumbromideEthylenediaminetetraacid％s／AceticAcid／EDTABasepair中文全称猪圆环病毒2型(猪)戊型肝炎病毒猪繁殖与呼吸综合征(病毒、)猪瘟(病毒)伪狂犬病(病毒)聚合酶链式反应逆转录聚合酶链式反应酶联免疫吸附试验转|分开放阅读框微克微升毫摩尔／升脱氧核糖核苷三磷酸猪皮炎与肾病综合征猪呼吸道疾病综合征断奶猪多系统衰竭综合征磷酸盐缓冲液溴化乙锭乙二胺四乙酸(Tris．乙酸)电泳缓冲液碱基对 文献综述第一章猪圆环病毒2型分子生物学研究进展1974年德国学者Tischer首次从猪肾传代细胞系PK．15细胞中发现了一种污染病毒，该病毒可持续感染PK．15细胞，但不产生细胞病变(CPE)。1982年他证实这是一种新病毒，并命名为猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)。随后发现引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(Post．weaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原与之既有一定同源性，也有一定差异。1998年Allan等【1．2】将从PMWS病料中分离到的圆环病毒称为2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)，而将以前从传代细胞系PK-15细胞中分离到的圆环病毒称为1型(Porcineckcovirustypel，PCVl)。实验证实PCVl无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系。而PCV2则是自1996年以来新发现的一种与PMWS密切相关的病毒，人工感染结果也证明它是PMWS的主要病原之一。研究表明，PCV2不仅是引起PMWS的重要病原，还与猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪皮炎与肾病综合征以及猪的先天性震颤等多种疾病密切相关。自1991年加拿大首次报道PMWS病例以来，陆续在许多国家报道了本病的发生。到了1994年，该病已广泛流行于美国、法国、西班牙、意大利、德国、丹麦、荷兰等许多国家和地区，本病的发生己呈世界性流行，且近年来呈逐渐上升的趋势。目前各国都在对该病进行深入的研究。在我国，郎洪武等【3】采集了来自北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7个省(市)22个猪群的559份血清，其中包括20日龄未断奶仔猪、1"--'2月龄断奶仔猪、后备母猪及经产母猪，用ELISA方法检测，结果总阳性率为42．9％，抗体阳性率随着猪年龄增长而升高。曹胜波等H通过DNA序列分析证实，PCV中国分离株与国外分离株同源性不是特别高，因此推测PCV2在我国存在的时间也比较长，经过多年的流行，病毒发生了变异。血清学调查发现，欧洲和加拿大等国家的家养和野生猪群中PCV抗体阳性率最高可达95％，大约5％～15％断奶猪出现症状，部分感染猪群中的死亡率高达40％。该病的发生和蔓延对世界各国养猪业已造成了严重的危害，给养猪业带来巨大的经济损失。2008年第20届国际猪病大会上，人们更将其列为当前危害养猪业发展的头号疫病。因此，对PCV2的研究成为近年来一个新的热点。 猜圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染1病原学猪圆环病毒(PCV)基因组由一个单股圆环状的DNA组成，是一种新发现的病毒，并将其命名为猪圆环病毒(PCV)。同时，经血清学调查发现在多数家养和野生猪群中PCV抗体阳性率很高(最高可达95％)；用PCV实验感染猪不引起临床症状和病理变化，故早期研究认为该病毒无致病性。在近年来对猪血清中猪圆环病毒2型(PCV-2)抗体及对猪组织样品所作的回顾性检测结果表明：PCV2至少从1969年起就已存在于猪群中了151。近年来，该病的发生呈上升趋势，在猪群中广泛流行，给世界养猪业造成了很大的经济损失。PCV可分为PCVl和PCV2两个基因型，其中PCVl基因组全长为1758一--1760bp，包含7个阅读框架；PCV2基因组分两种，一种全长为1767bp，另一种全长为1768bpt61。对PCV2的基因组分析发现PCV2分离株的基因组同源性都在90％以上，但与PCVl的核苷酸同源性却小于80％。PCV2通常含有11个ORFs，预计分别编码2～36KD的蛋白质。对PCVl和PCV2的ORFl分析发现二者核苷酸和编码蛋白的同源性分别为83％和86％，但ORF2却只有67％和65％的同源性，ORF3的氨基酸同源性为61．5％～62％，ORF4的同源性为83％171。PCV2呈现多基因型的态势，据基因进化数据PCV2又可以分为PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d，PCV2e等几个亚基因型，其中PCV2a和PCV2b是主要类型，PCV2c仅在丹麦发现。PCV2b在当前自然感染中流行，被认为有较强的致病性。遗传学发现PCV2a早于PCV2b出现。澳大利亚仅存在有PCV2a，却没有PMWS病例出现，由此分析PMWS的暴发与该病毒从PCV2a到PCV2b的改变有关。分析发现PCV2a和PCV2b有5个主要的区别：q)PCV2a基因组全长1767bp、PCV2b基因组全长1768bp，PCV2a在第1040个核苷酸缺失。(室)ORFl有314个氨基酸，PCV2a和PCV2b在ORFl中的942个核苷酸中有172个不同，占18％，其中在第152个核苷酸最稳定的变异位置，由于这个核苷酸的改变导致Gly52／Ar98／Ser2(PCV2b)改变为Ser70／Glyl(PCV2a)。③ORF3有104个氨基酸，PCV2a和PCV2b在ORF3上的312个核苷酸有51个不同，占28％的。④PCV2分为PCV2b主要是根据ORF2上的差异，在ORF2上有233个氨基酸，PCV2a和PCV2b在该阅读框上的699个核苷酸中有201个不同，占28％。⑤在ORF2阅读框，第1486。1472位置上PCV2a的核苷酸序列为TCAAACCCCCG，1487—1473位置上PCV2b的核苷酸序列为ACCAACAAAAT。2 文献综述第一章猪圆环病毒2型分子生物学研究进展1．1形态学和理化特性游离的PCV纯化的病毒样品，在电镜下可见直径约17nm、分布较分散、呈球状、边缘较清晰无囊膜的病毒粒子。感染PCV的PK．15细胞内含有许多胞桨内包涵体，少数感染细胞内还含有核内包涵体，大多数胞桨内包涵体分布于细胞核周围，呈圆形或卵圆形。PCV病毒粒子的浮力密度为1．379／em3，沉降系数为52S。PCV对外界环境抵抗力较强，病毒可抵抗pH3的酸性环境和56℃及70℃的高温环境，经氯仿处理不失活。病毒结构蛋白36000Da。该病毒高度稳定，且核酸的序列极度保守不易发生变异，这种对环境因素的高度抵抗力在流行病学和疾病防治中有重要影响。该病毒不具备血凝活性，不能凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞【81。1．2分类地位PCV在分类上属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)。圆环病毒科是1995年国际病毒分类学会(ICTV)第六次病毒分类报告新设立的一个病毒科。该科的共同特征为20面体对称，无囊膜，单股圆环状DNA，是目前已知脊椎动物病毒中最小的病毒。被列入该科的植物病毒有香蕉束顶病毒(BBTV)，椰子叶腐烂病毒(CFDV)，地三叶草矮化病毒(SCSV)等；动物病毒有鸡贫血病毒(CAV)，鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)，猪圆环病毒(PCV)等。Niagro等建议将圆环病毒分为3个群：似双病毒类嗜植物圆环病毒，包括SCSV，CFDV和BBTV；似双病毒类嗜动物圆环病毒，包括PBFDV和PCV；而CAV因在结构上与其他圆环病毒差异较大，而被列为另一类群例。2流行病学2．1临床症状与病理变化2．1．1临床症状PMWS是一种新发现的猪病综合征，临床特征主要表现为断奶猪发育不良、渐进性消瘦、皮肤苍白或黄疸，呼吸困难共济失调及突然死亡。体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结肿大，有时还有腹泻【101。有的报道有仔猪先天性震颤【111。另一个特征就是由于继发感染引起PMWS的症状复杂化、严重化而导致猪群死亡率的增加。2．1．2病理变化剖检见病猪体况差，肌肉不同程度萎缩：皮肤苍白；有的病例 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染出现黄疸；淋巴结明显肿胀或萎缩，其切面呈均匀的苍白色；肺呈现炎性病变，肿胀、坚硬或似橡皮，表面有灰色小叶，重者肺泡出血，颜色加深，尖叶和心叶萎缩或实变；肝瘀血、水肿，肝小叶问结缔组织增生；胰腺萎缩；肾脏水肿、苍白，被膜下有白色坏死灶；盲肠和结肠黏膜充血或瘀血；脾脏常肿大，呈肉样变化，但郎洪武等报道发现明显的脾萎缩现象Il叭12|。显微镜下见淋巴结血管扩张、充血，淋巴滤泡减少或消失，淋巴窦扩张，其内充满单核白细胞和其它炎性细胞，淋巴窦内有大量含铁血红素沉着，有些淋巴细胞萎缩，少数情况有坏死；淋巴结的基质常增生或有嗜酸性细胞浸润；肺呈现明显的支气管炎病变，支气管周围间质内有大量淋巴细胞浸润，支气管黏膜上皮增生，管腔内有黏液渗出；心肌有不同程度的多病灶性心肌炎，有多种炎性细胞浸润；肝脏表现不同程度的炎症，有淋巴细胞、巨嗜细胞和嗜酸性细胞浸润，胆管周围有纤维组织形成：脾白髓发育不良，少见淋巴滤泡，脾窦内有大量炎性细胞浸润，脾实质中有大量含铁血红素沉着：胰腺上皮萎缩，腺泡明显变小：胃肠平滑肌表现肌肉炎，其病灶中许多炎性细胞浸润，主要为嗜酸细胞，肠绒毛萎缩，黏膜上皮脱落；许多病猪肾脏的皮质和髓质也有炎症19。1¨。2．2宿主范围与传播方式2．2．1宿主范围Allan报道在牛、绵羊、鸡、火鸡、山羊、老鼠、兔子和人的血清中未能检测到PCVl抗体，但Tischer报道【131用问接免疫荧光和ELISA相组合的方法在人、老鼠和牛中检测到了PCVl抗体，抗体阳性率分别为30．2％、12％'---69％和35％。因此对于PCV到底是否感染人、鼠等其它动物还有待于进一步的研究，但PCVl在体外可以感染牛和猪的单核细胞而不感染人和羊的单核细胞这一点已经得到证实【8】o2．2．2传播方式PCV2对所有猪都易感，纯种猪及杂交品种猪均出现有典型的临床病例，研究发现不同品种的易感性存在差异。PCV2可经鼻、扁桃体、支气管、眼分泌物、粪便、唾液、尿液和乳等途径排毒，发病猪的排毒量远远高于无临床症状的猪，造成PCV2的水平传播。其最主要的传播方式为健康猪口鼻接触到感染猪的排泄物如粪、尿等，或者是与感染猪直接接触，混养造成PCV2感染的可能性比分栏饲喂的可能性大。通过哺乳方式是否能够引起感染尚在研究中。实验证明人工感染PCV2血清阴性公猪精液中含有PCV2的DNA，说明精液传播可能是另一种传播途径。现已清楚PMWS病猪可通过粪便和鼻分泌物排出PCV，引起病毒在不同猪个体之间进行传播。这种病毒在不同猪群之间的传播方式则尚不为 文献综述第一章猪圆环病毒2型分子生物学研究进展所知。但是和其他病毒的传播一样，猪在不同猪群之间的移动很可能是主要的传播途径。由于这一病毒结构简单，非常能耐受不良环境，所以也可能通过衣物和设备进行传播。鸟类、啮齿类动物如鼠等带毒，可能会引起传播。有试验证明，外观正常的公猪精液中可检测到PCV，也有报道从流产猪和死胎中检测到PCV【141，最早可在配种后5d检测到病毒散播。PCV2还可经胎盘由母猪传播给仔猪，造成仔猪心肌炎、流产、死胎等。3病毒复制3．1基因组结构PCVl基因组全长约为1759bp。PCV2基因组全长约1767或1768bp，分子量5．8×102，由一条单股共价闭合环状的DNA分子组成。病毒粒子约为17rim，病毒呈二十面体对称，有单层的衣壳多肽蛋白，分子量约为3．6×104，无囊膜，没有固定的表面结构。病毒DNA利用宿主细胞的酶自动以滚环方式复制。PCV的基因组为双义(ambisense)单链DNA，即PCV的病毒基因组本身及其进入宿主细胞后产生的互补链各自编码病毒一部分的蛋白。各PCVl株之间的基因组同源性和各PCV2株之间的基因组同源性都大于90％。PCVl株和PCV2株的同源性在68％到76％之间。Hamel等【151通过对PCV的基因组分析，发现这两株病毒均可能含有11个开放阅读框(OpenReadFrame，ORF)，其中ORFl，2，3，4，7和8具有一定的同源性，其余ORF无任何同源性。而ORFl和ORF2则是主要阅读框。ORFl序列的同源性较高为85％。ORF2序列的同源性低为66％。虽然PCVl和PCV2的基因组全序列的同源性不算太高，但它们的复制起始部位的核苷酸序列的同源性很高，复制起始部位的结构也很相似。它们的复制起始位置都位于ORF2(编码衣壳蛋白：Cap蛋白)和ORFl(编码复制相关蛋白：Rep蛋白)之问的区域。该区域含有11个核苷酸的回文序列5'-GAAGTGCGCTG一3。和5。一CAGcGCACTTC．3’，两段序列的互补配对就形成了一个茎环结构(stem—loop)，PCVl和PCV2的环部的核苷酸数量不一样(PCVl为12个，PCV2为10个)，但都含有相同的八核苷酸序列(5’一AGWarAC一3’)。其它基因组为环状单链DNA的一些病毒和质粒都也有相似的保守九核苷酸序列。3．2复制模式PCV的复制为滚环复制方式，先经过一个双链的复制型(I心)，然后由双链的复 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染制型转录和编码蛋白。这种复制方式与CAV病毒的复制相同。Tischer等【161在感染有PCV的细胞中观察到了PCV的双链DNA形式，它是一种超螺旋的松散的环状分子，转染试验表明，此种双链DNA具有感染性。病毒在细胞中复制需要依赖细胞生长周期S期的细胞表达蛋白，用D．氨基葡萄糖处理细胞培养物后，有利于病毒的复制，使含有PCV的细胞数量增加。在用病毒DNA转染细胞时，用DEAE．葡聚糖处理细胞培养物，亦可产生类似的效果。推测这两种试剂可能有利于促进病毒基因进入细胞核。4猪圆环病毒2型致病机理猪圆环病毒(PCV)被发现是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMwS)的主要病原之一。近年来又发现PCV2感染与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、心肌炎以及繁殖障碍综合征以及仔猪先天性震颤等多种疾病的发生密切相关，引起人们更多关注。猪圆环病毒2型(PCV2)主要侵入患猪肺脏、胸腺、脾脏中，致使循环B细胞和T细胞及淋巴器官中的B、T淋巴细胞数量减少和萎缩，从而导致免疫抑制的发生。PCV2感染发病的原因：一是由于猪群感染了PCV2病毒，二是受到其他因素的影响，例如猪舍温度不适、通风不良、不同日龄猪群混群饲养、猪体免疫接种应激，以及其它重要病原体混合感染等。4．1PCV对猪免疫系统的影响4．1．1PCV对淋巴细胞的影响Nielsen(2003)【17】通过单克隆抗体和流式细胞仪分析，与健康动物相比，在外周血中T(主要为cD4+)和B细胞数量下降，出现密度较低的不成熟粒细胞，感染细胞集中在淋巴滤泡区，受害的淋巴组织有不同程度的淋巴细胞缺失和单核细胞浸润，说明PCV2感染猪不仅T细胞免疫应答受损，而且体液免疫也受到损伤。外周血中抗原提呈细胞的提呈能力下降，说明PCV2感染猪淋巴细胞和巨噬细胞激活途径存在缺陷。对患猪外周血T细胞亚群和IgM研究发现，患猪与正常猪相比，外周血中CD4+细胞和CD4+、CD料双阳性T细胞数量明显下降。此外，淋巴组织中PCV2数量与这些组织的细胞衰竭呈正相关，而与外周血中IgM和CD4+细胞数量呈负相关，说明患猪免疫应答降低。对猪外周血单核细胞系统研究发现，患猪外周血单核细胞数量较正常对照组明显增多，暗示PCV2诱导单核／巨噬细胞分化或增殖。McNeillyF等[181用适应PK．15细胞培养的病毒感染猪肺泡巨噬细胞，发现PCV2感染后，并不影响肺巨噬细胞的吞噬能力，也不影响其杀死补体包被酵母细胞的能力和Fc或补体受体的表6 文献综述第一章猪圆环病毒2型分子生物学研究进展达水平；感染后4d观察到在PCV2感染细胞中MHCI型复合体的表达暂时性增加，感染后8d可观察到表达MHCII型抗原的细胞数量减少。VincentIE等【19】把PCV2感染的树突状细胞和T淋巴细胞群共同培养，发现感染的树突状细胞并不把PCV2传给淋巴细胞，也不诱导PCV2的复制，也不影响两种细胞的繁殖能力。SegalesJ等[20l用流式细胞技术分析PMWS猪外周血液单核细胞亚群的变化时，发现在PMWS感染猪的外周血液中的淋巴细胞亚群变化很大，特点是单核细胞增加，T细胞(主要是CD4+)和B细胞减少，出现密度较低的不成熟粒细胞。DarwichL等【2l】也得到了相似的结果，试验中，PCV2感染猪的B细胞和T细胞(主要是CD4+和CD叶)数量比阴性对照猪的T、B细胞数量显著降低；而且，具有严重临床症状和病理变化的PCV2感染猪的B淋巴细胞和CDS+T细胞的数量明显低于症状和病变较轻者。SanchezJrRE等【22J将妊娠后期第92天／104天的胎儿和1日龄新生仔猪分别接种PCV2，接种猪都没观察到临床症状。而且接种猪的病毒滴度一直都很低，只有少数比其同窝猪高2～4lgl0。在大多数病毒滴度较低的接种仔猪中，感染细胞表型为单核细胞和巨噬细胞，几乎没有CDl4+细胞，也没观察到淋巴细胞缺失和单核细胞浸润。在病毒滴度较高的5个仔猪中，都有不同程度的淋巴细胞缺失和单核细胞浸润，感染细胞集中在淋巴滤泡区。4．1．2PCV对细胞因子的影响DarwichL等【23】发现，感染PCV2的猪胸腺和扁桃体中的IL．10和IFN-丫的mRNA的量有所增加，而淋巴细胞中IL．2，IL．4，IL．10，IL．12和IFN-7的mRNA水平有所下降，但其IL一1D和IL一8的mRNA水平却上升。这些变化(尤其是IL．10表达增多)表明PCV2可以导致T细胞免疫抑制。SiposaW等1241用半定量RT-PCR和流式细胞仪分别从mRNA水平和蛋白质水平检测了几种细胞因子表达量的变化。其中半定量RT-PCR在血液中检查表明，IL。l0【和IL一10mRNA在感染猪体内明显上升，而IL一2和IL．2Ra(CD25)的mRNA却下降，IL．8，TNF．仅和IFN-TmRNA则轻微上升。用流式细胞仪检测细胞内的细胞因子水平变化发现，IL一1p，IL．2和IL．6上升，IFN．Y轻微下降，而IL．12和TNF．u表达没有变化。IL-10mRNA的上升是导致免疫应答不平衡的必要条件。IL一1p和IL一6上升可以导致单核巨噬细胞的激活，IL．8和TNF．amRNA轻微上升可能与粒细胞浸润细支气管炎的问质性肺炎有关。IL一4表达的下降可能会导致特异性的体液免疫应答下降。IFN吖mRNA轻微上升而蛋白水平轻微下降不能有效产生保护性的Thl免疫应答。MeertsP等125J发现IFN吖可以增强PCV2在PK．15细胞系和3D4／3l细胞系的感染和增殖。共聚焦显微镜观察表明，IFN吖对PCV2增殖是通过增加PCV2样病毒粒子(VLPs)细胞内摄作用来实现的。参与免疫调节的细胞因子表达数量的改变使得PCV2感染后淋巴细胞不能有效地 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染激活和增殖，继而导致巨噬细胞表面抗原瑚CI类分子和MHCII类分子表达下降，最终破坏免疫功能【261。4．1．3PCV感染的靶细胞PCV复制的靶细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和多核巨细胞等抗原递呈细胞以及肾小管、支气管的上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和淋巴细胞。从定量的观点看，与其他类型的细胞相比，单核巨噬细胞系统中PCV2的量最大。然而，令人迷惑的是DNA病毒包括PCV应该是在细胞核内复制的，但在单核／巨噬细胞系统的胞浆中发现大量的病毒，而胞核内很少【27】。目前对PCV与免疫细胞相互作用的详细机制还不太清楚，我们所了解的仅仅是PCV可以与一些吞噬细胞及上述的一些免疫细胞发生作用并被吞噬，究竟PCV是采取何种方式进入靶细胞的目前不是很清楚。应用分子标记手段，可以观察到大部分巨噬细胞中有病毒颗粒存在，在其他上皮细胞或内皮细胞细胞核内也有病毒的标记，表明这些类型的细胞可能在病毒的产生过程中发挥重要作用。树突状细胞(DCs)在先天免疫及被动免疫反应中具有重要作用，因而它们也是病毒感染的关键靶器官。研究证明90％～90％来自于单核细胞或骨髓瘤细胞的DCs与PCV2相互作用，与早期的感染很相似，虽然没有证据表明病毒能够在其中复制，但是病毒在这些细胞中持续性存在并不丧失感染性也不会诱导细胞的死亡。这些结论都证明PCV2能够在病毒不复制或降解的情况下持续性存在于DCs细胞中，这样一种沉默病毒感染不仅提出了关于免疫逃避也是关于DCs降解逃避的一种新颖机制，由于它们的迁移能力，使得感染病毒的DCs成为一种潜在的可在宿主体内不需要复制就能传播病毒的工具【28】。SanchezJrRE等[291对妊娠期的57，75，92d的胎儿子宫内接种PCV2，同时对1日龄的仔猪接种PCV2。接种后21d，用不同细胞标记物的双免疫荧光标记和PCV2抗体对心脏、肺脏、肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结的PCV2感染细胞进行定位和免疫分型。胎儿期，在心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞中检测到病毒抗原，随着接种时胎儿日龄的增加，感染细胞的数量减少。心脏含有的感染细胞的数量最多，心肌细胞是主要的靶细胞。对新生仔猪来说，巨噬细胞是不同组织中唯一的感染细胞，感染细胞的数量与妊娠期第92天接种胎儿时的感染细胞数量相似。此研究表明PCV2的靶细胞在胎儿期是心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞，而出生后只有巨噬细胞。4．2各种因素对PCV感染的影响4．2．1病原微生物的影响PCV2感染猪的免疫系统受损，免疫力下降，其它病原微生物继发感染或混合感染都可加重PCV2感染猪的病情，表现为明显的PCV2感8 文献综述第一章猪圆环病毒2型分子生物学研究进展染临床症状。PeschS等【30l用细菌检测和PCR方法对102个猪场中的171个PCV2疑似病例进行了病原检测，检测的病原有PCV2、欧洲型PRRSV野毒、细小病毒(PPV)、衣原体、猪流感(Sly)、肺炎支原体(M．hvo)和胸膜肺炎放线杆菌(APP)等，大约有60％样品呈现PCV2和PRRSV-EU阳性。这个结果可以认为在调查的猪场中PMWS和间质性肺炎是混合感染引起的：在大约30％的病例中发现PDNS是由PCV2和PPV混合感染引起的；大约11％的PMWS的病例与PPV有关。在集约化猪场中猪肠道衣原体感染仅在少数PMWS病例中检测到。在问质性肺炎中除了PRRS野毒作为主要病原之外SIV、APP和M．hyo作为继发病原体被检测到。在和这些病原体单一感染的对比中，PCV2混合感染引起的间质性肺炎比PCV2单独感染所引起的病理损伤和临床症状更严重，治疗效果更差。PCV2和PRRSV混合感染的组织病理学特点是增生性坏死性肺炎(PNP)。他们发现要产生PCV2相关疾病的临床症状和病理变化，其它病原体的继发感染或混合感染很重要。呼吸道病原体可以引起问质性肺炎，PPV可以引起PDNS和PMWS，猪衣原体可以引起PMWS。因此，PCV2相关疾病似乎会被作为主要组成的PRRSV和其它附加或继发的病原体而推动。ChangHW等pl】在研究PCV2和PRRSV病毒单独和联合感染对猪肺泡巨噬细胞的影响时发现，PRRSV单独感染可直接或间接引起猪肺泡巨噬细胞功能急剧紊乱；而PCV2在PRRSV感染前或同时感染可引起的猪肺泡巨噬细胞紊乱降低，检测发现，所有PCV2感染组的IFN2a量明显升高，表明PCV2是IFN一2a的诱导剂，可能会使随后或同时感染的PRRSV感染率和复制率下降。推测PCV2和PRRSV不同的感染顺序也许可以解释在实地情况中PMWS疾病模式的差异。4．2．2免疫刺激的作用在一定条件下，作为应激效应，免疫刺激可能有助于PCV2在猪体内的复制，对PMWS临床症状的形成可能具有促进作用。KrakowkaS等[321将PCV2接种1日龄限菌猪，在3日龄和7日龄注射KLH(keyholelimpetheamocyanin)的弗氏不完全佐剂混合物，结果显示，只接种PCV2的仔猪无一出现PMWS症状；但是，接种过PCV2和KLH弗氏不完全佐剂混合物的仔猪都表现出中等或严重的PMWS症状。KyriakisSC等【33】用一批来自曾经发生过PMWS的猪场的仔猪进行试验，结果发现，分别接种过支原体性肺炎疫苗和免疫增强剂的两组实验猪群PMWS的发病率为42．9％和50％，明显高于阴性对照组的10．7％。Ladekjaer-Ladekjr-MikkelsenAS等mJ对3周龄PCV-2血清学阴性的SPF小猪鼻腔内接种PCV2，再用弗氏不完全佐剂乳化的KLH疫苗免疫动物。结果发现，绝大多数试验猪的临床症状、全身病变或组织学上并无明显差异。即SPF猪感染PCV2可引起PMWS，但免疫刺激似乎并不能起关键作用。ResendesAR等【351用PCV2和佐剂共同接种寻常猪时也发现，作为疫苗佐剂的免疫激活剂一般不足以引起PMWS，也不增加9 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染猪中的PCV2的量。而且PCV2能引起较长时间的亚临床感染而没有明显的临床症状。OpriessnigT等研究年龄和疫苗(胸膜肺炎放线杆菌和猪肺炎支原体菌苗)诱发的免疫激活剂对PCV2感染的影响时，没有发现年龄和免疫刺激对PCV2相关疾病的发生率和病损严重性有影响。即免疫刺激不一定能引发PCV2感染猪发病。10 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文献综述第一章猪圆环病毒2型分子生物学研究进展CytokineRes，2005，25(11)：684—693．[26】DoneSH，BaileyM，GreshamACJ,eta1．Post-weaningmultisystemicwastingsyn-drome(PMWS)．ThecurrentEuropeansituation[J]．PigJ，2002，49：215—232．【27】ChianiniF,MajoN，SegalesJ,eta1．ImmunohistochemicalcharacterizationofPCV2associatelesionsinlymphoidandnon—lymphoidtissuesofpigswithnaturalPMWS[J]．VetImmunolImmunopathol，2003，94：63-75．【28】VincentE,CarrascoCP,HerrmannB，eta1．Dendriticcellsharborinfectiousporcinecircovirustype2intheabsenceofapparentcellmodulationofreplicationofthevirus[J]．JVirol，2003，77(24)：l3288．13300．[29】SanchezJrRE，MeertsP,NauwynckHJ，eta1．Changeofporcinecircovirus2targetcellsinpigsduringdevelopmentfromfetaltoearlypostnatallife[J]．VetMicrobiol，2003，95(122)：15．25．[30】PeschS,JohannsenU，Strijks打aG,eta1．ScreeningforpathogensinPCV2associateddisease[A]．Proceedingsofthe4thCongressoftheInternationalPigVeterinarySociety[C]．Rome：PalazzodeiCongressi，2003：205—206．[31】ChangHW,JengCR，PangVF．EffectofPorcinecireovirustype2andporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection，singularorcombinated，onswinealveolarmacrophages[A】．Proceedingsofthe4thCongressoftheInternationalPigVeterinarySociety[C]。Rome：PalazzodeiCongressi，2003：190—191．[32】KrakowkaS,EllisJ，McNeillyF,eta1．ActivationoftheimmunesystemisthepivotaleventintheproductionofwastingdiseaseinpigsinfectedwithPorcinecircovirus2[J】．VetPathol，2001，38：3l一42．[33】KyriakisSC，SaoulidisK，LekkasS，eta1．Theeffectsofimmunomodulafionontheclinicalandpathologicalexpressionofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J]．CompPath，2002，126：38—46．[34】Ladekjr-MikkelsenAS，NielsenJ，KrakowkaS，eta1．ComparisonofpmhogeniceffectofdifferentPCV-2inoculmionondevelopmentofPMWS[A]．Proceedingsofthe17thCongressoftheInternationalPigVeterinarySociety[C】．Ames，Iowa：USAScientificCommitteeofthe17thIPVSCongress，2002：199．【35】ResendesAR，BalaschM，CalsamigliaM，eta1．ExperimentalCO—inoculmionofPorcinecircovirustype2(PCV2)andavaccineadjuvantinconventionalpigs：Dynamicsofviremia，seroconversionandviraldetectioninnasal，fecal，tonsiilarandurinaryswabs[A]．Proceedingsofthe17thCongressoftheInternationalPigVeterinarySociety[C]．Ames，Iowa：USAScientificCommitteeofthe17thIPVSCongress．2002：2012．13 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展戊型肝炎(hepatitisE，HE)是一种人畜共患病，它是由戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)引起的一种经肠道传播的非甲．非乙型肝炎(ET-NANBH)⋯。HEV可通过粪．口途径传播，经常会引起水型爆发或食物型爆发，导致戊型肝炎的发生，严重危害人类的健康。目前认为，戊型肝炎的传播途径为动物_人_人。此病毒呈全球分布，在一些卫生条件较差的发展中国家及地区曾多次发生爆发型流行，有报导20世纪80年代我国新疆地区爆发了一次大规模的水型戊型肝炎流行，累计发病人数近12万人，最近几年来，在这些地区的散发型流行呈上升趋势，造成巨大的社会危害和经济损失。在发达国家，由于卫生条件较好，该病毒主要呈散发型流行。人对HEV易感，发病重，病死率高，轻壮年病死率1％～2％，孕妇高达20％t引。此病毒是一种严重危害入畜健康的肝炎病毒，猪是HEV常见的中间宿主之一13J，其感染HEV常呈隐性过程，基本无症状，但在其感染过程中可排出HEV，污染环境导致人HEV的发生。非灵长类动物、啮齿类动物、猪、牛、羊、鸡，这些动物感染HEV后多表现为亚临床感染。人与感染动物的接触引起HEV的种系交叉感染，特别是兽医工作者和饲养人员易被感染，是一个重要的公共卫生问题。猪的HEV的研究对控制HE的传染源、切断传播途径，HE的诊断、病原学及疫苗研制均有重要意义和应用价值。猪作为新兴组织工程学的重要移植供体，在进行相应的人体器官移植研究和利用猪的细胞或器官之前，应该考虑对猪进行戊型肝炎病毒检测以排除相应感染。可见，对猪HE发病因素的研究，关系到人类健康，具有深远的食品安全意义和巨大的经济价值。19丙腺掌HEV是一种无囊膜的单股正链RNA病毒【4】。病毒粒子为正二十面体，无囊膜的球型颗粒，直径为27"～34nm，表面有刺突(spikes)和缺刻(indentation)，内部呈两种不同形态：一种内部密，为完整的病毒颗粒，另一种内部含电荷透亮区，为不含完整基因的缺陷病毒颗粒【51。蔗糖梯度离心前者沉降系数为185S，后者为165S。病毒颗粒在蔗糖溶液中的浮力密度为130mg／cm3，在酒石酸甲溶液中为l18mg／cm3。HEV稳定性较差，病毒对高盐、氯仿、氯化铯敏感。4"C下保存容易裂解，反复冻融以及在蔗糖中可结成团，导致病毒活性下降。在碱性环境中较稳定，在镁和锰离子存在下 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展可保持病毒颗粒的完整【6l，加热至56℃持续1h或用乙醚处理5min均不破坏HEV的抗原反应性。由于形态上与嵌杯样病毒(Calicirirus)相似，过去把它归为嵌杯样病毒科，虽然在结构和基因组序列上和杯状病毒非常相似，但戊型肝炎病毒与风疹病毒和辛德毕斯病毒具有较弱的种族联系，基因组序列分析发现其不同于嵌杯样病毒科其它成员，故被否定。ICTV第八次报告建议将其暂时归入一个独立的科：戊型肝炎病毒样病毒科。2流行病学图2．1HEV病毒颗粒负染电镜照片Fig．2-1VirionsoftheHEVbynegativestainingunderEM2．1传染源2．1．1人用RT-PCR技术可在急性期戊肝病人粪便标本中检测出HEV-RNA，与病人的生殖道分泌物、血液、粪便接触，可使血清转胺酶(ALT)升高，抗HEV-IgM及IgG阳性【71，说明戊肝病人是重要的传染源。1983年前苏联病毒学家Balayan等应用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为27nm'--'30nm的病毒样颗粒，从而证实该病毒为一新型非甲．非乙型肝炎病毒。1990年Reyes[81等首先应用分子克隆技术得到了该病毒的基因克隆，并进行了序列分析。1998年在东京召开的国际会议上，正式将此型肝炎及相关病毒分别命名为戊型肝炎(hepatitisE，HE)和戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)。2．1．2动物Balayan等用成人戊型肝炎患者粪便提取物接种4头幼猪，从感染猪粪便中可检测出HEV颗粒，并在接种第6天ALT水平升高。葛胜祥等【9】对我国20个省、市、自治区的120个养猪场的8626头成年猪进行了HEV血清学调查。结果显示，每个猪场均发现有HEV感染，感染率为68．0％至99．O％不等。说明家猪在传播 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染HEV中可能起重要作用。1991年俄罗斯Yaoriv等【l0】在调查HEV感染疫区生物圈的研究中，发现小家鼠、小林姬鼠、土耳其鼠能感染HEV。毕胜利等【11J报道，黑猩猩对HEV敏感可作为研究戊型肝炎的动物模型。Arankalle等[121进行过犬HEV抗体的ELISA检测，在40份犬血清标本中检测到10份标本HEV抗体阳性。丁福等【l3】检测了3种不同犬血清标本中的HEV抗体，结果显示，警犬HEV抗体阴性，家犬HEV抗体阳性率为15．19％，宠物犬阳性率为4．65％，说明犬对HEV易感，犬在HEV传播中可能起了重要作用。赵素元等【14】用疫区的野鼠进行HEV检测，并用戊肝病毒实验感染鼠，证实野鼠及人工驯化繁殖3代以上的草原兔尾鼠、子午鼠对HEV敏感。有报道日本有戊型肝炎患者是因为食用鹿肉而被感染，提示戊型肝炎病毒从鹿到人的动物性传播。自从Meng等发现猪源HEV与美国本土急性戊型肝炎患者分离的HEV核苷酸的同源性在92％以上，属基NIII型【l51，此后各国纷纷对HEV的动物宿主进行研究，最近更有日本学者报道人由于食用生鹿肉及猪肝而患HE，追踪性调查发现在剩余鹿肉检出与患者相同的HEV[16】，其ORFl部分核苷酸序列同源性达99．7％100％【171o序列测定表明在美国和日本发现的猪戊型肝炎病毒与人类戊型肝炎病毒非常相近。2．2传播途径2．2．1经水传播戊型肝炎(HE)病人和实验动物可于潜伏期末和急性期早期随粪便排出大量病毒，并借助水在人群中传播，即粪一口形式进行传播，主要是饮用水污染引起。水型爆发多发生于卫生条件较差的发展中国家【18】。2．2．1经食物传播食物传播多由潜伏期末和急性期早期病人粪便污染的食物和食具所致【l引，也可通过食用戊型肝炎病毒污染的动物肉类(如未熟透的血、肝脏)。1993年北京曾发生2次戊型肝炎爆发，经调查为食物型爆发【19】。2．2．1日常生活接触传播有研究表明，有戊型肝炎病人的家庭成员HEV阳性者比无戊型肝炎病人的家庭成员要高，统计结果表明两者的HEV阳性率有显著差异Jig]，但接触传播率明显低于甲肝的接触传播率。2．3人群及动物的易感性人对HEV普遍易感，发病率高。一般青壮年以临床感染为主，儿童以亚临床和隐性感染居多。青壮年的戊肝病死率可达1‰2％，比甲肝高9倍【20】。戊型肝炎是一种轻度至中度的传染病，死亡率O．4％～4．O％。WHO称，“除了怀孕的妇女，在孕期3个月后死亡率逐渐升高，可以达到20％”。人群中存在戊型肝炎病毒肠道急性爆发4 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展和零星的急性发作。戊型肝炎病毒需要2至7周的孵化期，主要在水体中广泛传播。在印度发生过水源性的大流行，孕妇的发病率和死亡率最高。病人痊愈后有一定的免疫力。到目前为止，己发现HEV在非人灵长类动物、猪、啮齿动物、牛、犬和鸡中有分布和传播。HEV感染这些动物后多表现为亚临床感染，这也可以解释为什么在很少发生HE流行的发达国家的健康人群中，既无黄疽肝炎病史，又否认到过任何HE流行疫区，血清中抗HEV抗体阳性率却很高。2．4流行特征戊型肝炎病毒常常引起病毒性肝炎的流行，本病流行地域广泛，在五大洲的国家中均有发生。戊型肝炎被认为是亚洲、非洲和中美洲等热带和亚热带的地方病，但是，同时也发现在较少可能致病的地区也同样存在着戊型肝炎病毒广泛的分布。急性戊型肝炎在发达国家如澳大利亚、法国、以色列、西班牙、英国、日本和美国均有发生，这些病例往往有戊型肝炎流行地区旅行史，但也有少数报道病例无旅游历史。总体来说，HE在发展中国家以流行为主，散发也常见，在发达国家以散发为主。中非共和国健康官方报道2004年6月17日称首都班吉附近的三座城市发生了戊型肝炎病毒流行的爆发。人民网日本版2005年7月22日讯共同社报道，戊型肝炎(脏)最近在日本被发现有多人感染，并且已有1名患者死亡。在众多感染者中，以居住于北海道、东北地区的人为最多。(东京)东芝医院的三代俊治研究部长等调查，除了死亡的患者外，还有7人也感染了这种戊型肝炎。推测认为，戊型肝炎在日本国内至少有3个传播途径，不过还不能确定感染源来自何处。相关研究小组调查，在上个世纪90年代时有2人也死于戊型肝炎。另据报道2005年7月22日上午，日本有关部门宣称在枥木县一个养猪场的3头猪的血液中检测出了与戊型肝炎的遗传因子非常相似的病毒。其中，从1头猪身上检测出的病毒遗传因子与在国内1名患者血液中查出的戊型肝炎病毒也非常相似，但是还不能确定两者问有何关联。虽然戊型肝炎是一种人畜(兽)都可能感染的病症，据称这还是日本首次从动物身上检测出戊型肝炎病毒。我国自1982年起就有关于戊型肝炎的报道【2l】。本病多见于卫生条件差的农村地区，经污染的水或食物传播，常引起暴发或流行。至今我国不同的省市自治区中先后报道了11次戊型肝炎流行，其中5次为水型流行，6次为食物型暴发[221。我国几乎所有省市自治区均有散发性戊型肝炎病例发生，约占急性散发性病毒性肝炎8．6％【231。急性散发性戊型肝炎具有下列特征：①86．4％病例发生在20"--'59岁年龄组，20岁以 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染下和60岁以上病例分别占5．1％和8．5％；②男性病例多于女性，男女之比为2．3：1．3；③发病呈秋冬季节性：④75％病人有肝炎接触史，和／或有在外饮食史，或喝生水史；⑤临床特点类似甲型肝炎(病症是眼睛微黄、易疲劳以及胃痛)，不发展成慢性，但其病死率(2．5％)明显高于甲型(0．1％)肝炎。黄少新Hal对戊型肝炎流行地区戊型肝炎病毒抗体的年龄分布进行了研究，并与甲型肝炎抗体的分布情况进行了比较。相对于HAV抗体流行率，HEV抗体流行率表明在感染后，血液循环中HEV抗体消失要比HAV抗体消失快，儿童不会象成人那样快产生抗体。人工感染HEV的潜伏期是32d。由于在流行地区无合适的敏感性和特异性强的诊断系统，这些观点还没有得到澄清。对戊型肝炎流行区和非流行区一般人群血清抗．HEV流行率的现况研究表明，两者的年龄分布不同。抗HEV流行率在非流行区随年龄增长而上升，而在流行区则随年龄增长而下降[241。对新疆某流行区人群随访研究发现，HEV亚临床型感染以儿童多见，随年龄增长而下降。而临床型感染则随年龄增长而上升，以成人最为多见。0～10岁组亚I临床型占93．8％(15／16)，临床型仅占6．2％(1／16)。20----30岁组亚临床型降至8．3％(1／12)，而临床型则升至91．7％(11，l2)。3戊型肝炎病毒感染的诊断对戊型肝炎的诊断，最初主要是根据临床表现和流行病学特征用排除法加以诊断。HEV感染和病毒复制的证据主要是：①肝脏检测到HEV抗原(HEV-Ag)；②粪便或血清HEV-RNA检测阳性；@HEV抗体转化。具有以上特征并且有血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平显著升高或组织病理变化的病毒性肝炎，可以诊断为戊型肝炎。近几年已经建立了～系列特异性实验室诊断方法，常用的有以下几种方法：3．1ImPCR法RT-PCR法可以较灵敏的检出含量较少的HEV-RNA。对HEV的PCR扩增几乎覆盖整个基因组，由于这一病毒基因组碱基组成除ORFl的1500-3000碱基基因区域有一定变异外，其余部分保守性和特异性都较强，可以对任何一段基因序列进行PCR扩增。1990年Reyes等【25】首先克隆出HEV(B)的部分基因片段，他们从实验感染HEV的猕猴胆汁中提取出病毒RNA，经PCR扩增后，在ygtl0中构建eDNA文库，经32P标记的探针杂交筛选，获得克隆ETl．1，大小接近1．3Kb，可与猕猴肝脏中的HEV-RNA杂交。1991年，Yarbough等【26】克隆出另一亚型HEV(M)的部分基因片段，他们从墨西哥戊肝病人粪便中分离出病毒RNA，经扩增后，在ygtll中构建cDNA 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展文库，获得406．3—2(ORF2)和406．4．2(ORF3)两个克隆。此后，Tam等Ir271、Huang等【281及Bi等1291相继采用PCR方法，克隆出HEV(B)、HEV(M)和中国株的全基因序列。用于检测HEV常用的是逆转录一套式PCR(RT-nPCR)，由于戊肝病毒的基因型不同，因此用于PCR的引物设计非常关键。一般来讲，在设计PCR引物时，选择与l型或2型非常特异的基因序列，而3"-'8型是采用简并引物进行扩增，该类引物可以扩增同源性较低的同类序列，因此对戊肝的检出率很高。常见的做法是：先提取HEV-RNA，然后经逆转录合成eDNA，再用至少两对相应的HEV特异性引物进行套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳或Southen杂交实验。PCR产物可用于基因测序和分析。3．2酶联免疫吸附实验(ELISA)ELISA是目前用于检测血清HEV抗体最常用的方法，其中以间接ELISA用途最广。最初HEV血清学的检测是免疫电镜技术和荧光抗体阻断技术，两种方法利用的都是天然抗原，虽然这些方法特异性好，但是敏感性低，在HE爆发流行时也只能检测到50％，--70％的HE患者，并且在急性感染后几个月就无法再检测到抗体。随着HEV的克隆与测序，出现了一系列的血清学检测技术，包括Western转印(WB)和酶免疫测定技术(EIA)，这些技术都是利用ORF2和ORF3抗原表位的基因工程表达蛋白和合成肽作为抗原，和以天然病毒作为抗原相比，敏感性提高到90％--一95％t如】。用于检测HEV的抗原有3种即：组织培养全病毒抗原、合成肽抗原和表达抗原，目前最受关注的是表达抗原。常用的表达抗原有ORF2的表达抗原，ORF3的表达抗原以及同时含有ORF2和ORF3编码产物的重组表达抗原。3．3血清中和实验Meng等人在PCR基础上建立了快速血清中和实验(rSNA)。其具体做法是：将100培养细胞感染剂量的HEV加入到灭活补体的待测血清中，在37。C共孵育lh后接种到单层的PLC／PI江一5培养细胞中，37℃下作用2h，然后用Hanks液洗涤，抽提病毒RNA进行RT-nPCR扩增。感染HEV后的血清，在ALT升高之后，培养细胞中便测不到HEV-RNA。与ELISA检测方法对比，中和抗体的出现早于ELISA检测抗体。中和抗体的出现与RT-PCR检测的HEV-RNA消失相关。这种方法可以用作ELISA检测的确证实验，从而减少它的假阳性率。 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染3．4免疫荧光试验(IFA)IFA用于检测HEV抗体，在HEV感染期问，免疫荧光实验可检测到肝细胞组织中的HEV的特异性抗原。用荧光素标记纯化的抗HEV-IgG去检测实验感染猴肝组织中的HEV-Ag，敏感性可达90％以上，通过免疫荧光阻断法证实其有高度的特异性，与其他型肝炎间无交叉反应。本法敏感性、特异性均高，但需取肝组织检查，故其应用也受到一定的局限。3．5免疫印迹(IB)用重组的表达抗原检测病人血清中的抗HEV-IgM和IgG抗体。IB法具有特异性高，敏感性也较高，是证实戊肝爆发流行快速有效的方法，但其操作复杂，也有非病毒成分导致假阳性的可能，然而现在先用大肠杆菌溶解物吸收待测血清中的非特异性抗体及采用两次SDS．PAGE进一步纯化C2的方法，这就使得假阳性问题得到克服，故对疑为假阳性的标本可用此法给予证实，根据上述的优缺点，目前WB法主要用于科研。3．6免疫电镜(IEM)免疫电镜法是最早用于检测HEV感染的手段，以戊肝病人或实验感染动物的急性期、恢复期血清作已知抗体检查待测粪便、胆汁标本中的HEV颗粒，以观察到粪便标本中有由抗体包裹的3个以上病毒颗粒或经与抗体反应后的病毒凝集物至少3个以上则判为阳性，如仅见1个或2个这样的病毒颗粒，应再次检查此标本，如仍有病毒颗粒或上述的凝集物存在则判为阳性。该法的优点是直视可靠，但敏感性差，且特异性抗体来源有限和需用电镜，这就使其应用受到了较大的限制。3．7限制性内切酶消化法纯化、提取病毒RNA、用两对相应引物对HEV编码解旋酶、聚合酶和部分病毒衣壳蛋白的基因进行RT-PCR扩增，用不同的内切酶对PCR产物酶切分析，既可检测有无HEV感染，也可以对HEVRNA进行基因型分型。4戊型肝炎病毒的细胞培养通过对HEV基因的克隆与测序，使人们对HEV有了较多的了解，但由于缺乏合适的体外培育系统，影响了HEV分子生物学特性的进一步研究。HEV细胞培养十分 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展困难，学者们用原代细胞、二倍体细胞及传代细胞做了许多尝试。4．1原代细胞Tam等【3l】用HEV缅甸株感染猕猴，当ALT明显升高时，从活检组织中分离感染HEV肝细胞。将细胞置于添加了激素和生长因子的无血清培养液(SFM)中培养，在培养过程中，用RT-PCR一直能在细胞中检出HEV-RNA，证实该细胞系能在体外支持HEV复制。随后，Tam等【321将感染HEV的肝细胞培养上清与正常猕猴肝细胞共孵育、传代，在传3代的肝细胞中仍可检出HEV-RNA。4．2二倍体细胞Huang等用从新疆分离的HEV87A株的粪便悬液接种人胚肺二倍体细胞(2BS)并连续传代。该病毒能够与来自新疆、缅甸、印度及前苏联的戊肝病人的急性期血清反应，而与恢复期血清的反应则较差。在第2次传代细胞培养的第3天观察到典型的CPE，即胞浆出现病毒包涵体，细胞变圆与破裂，并观察到病毒颗粒在胞浆中呈晶格状排列。4．3传代细胞Huang等【33]在人肺癌细胞系A594中成功克隆复制HEV87A株。Panda等[341m完整的HEV印度株进行eDNA克隆，并用此eDNA体外转录得到的RNA转染人肝细胞系HepG2获得成功。5猪戊型肝炎病毒的分子生物学5．1基因组特征HEV基因组全长eDNA的成功克隆使得HEV分子生物学的研究得以迅速开展【35’36J。目前已经有多个HEV分离株成功地进行了全基因克隆。作为ET-NANBH的一个主要的独立致病因子，HEV是一单股正链RNA病毒，基因组全长约7．5kb，由7194个核苷酸(nt)和3’端Poly(A)尾巴组成，编码2400-2533个氨基酸，由5’端非结构区(NS)和3’端结构区(S)组成，5’端和3’端各有一非编码区(NC)，5’端NC区长28bp，3’端NC区长68bp。全基因组有三个开放性读码框(ORFs)，ORFl起始于HEV基因组5’端第28nt，延伸5079bp，终止于第5107nt，长约5kb，编码1693个氨基酸，有三个高度的保守序列(GDD序列)。与编码RNA依赖性的RNA聚合酶有9 猪圆环病毒2型!j猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染关，GVPGSGKS和DEAP序列，这2个序列部位可以与M92+结合形成M92+-NTP复合物，激活RNA依赖性NTP酶。这三个保守序列存在于所有的HEV中。ORFl第2011～2325nt为HEV相对高变区，编码105个氨基酸，可能与HEV重要功能基因相对稳定，而不重要的基因区高度突变以适应病毒的生存和进化有关。ORFI主要编码与HEV-RNA复制相关的非结构蛋白，其中存在几个相对保守区域，分别编码RNA依赖性RNA聚合酶、甲基转移酶、RNA解链酶、RNA聚合酶、Y结构域、X结构域及番木瓜蛋白样蛋白酶。甲基转移酶的出现提示HEV基因组RNA可能带有一个帽子结构，由于甲基转移酶的作用使帽子结构中5’端鸟苷甲基化产生m7G(5’)PPP(5’)x结构。Yaminal37J等报道了HEV基因组RNA有帽子结构的证据。用反转录PCR从两个不同基因型的HEV中提取RNA，7．甲基鸟苷(m7G)抗体结合RNA，帽子结构竞争性抑制病毒RNA的结合，显示HEVRNA基因组带有帽子结构。ORF2起始于ORFl的3’端第38nt，即全基因组第5147nt，延伸1980bp，终止于Poly(A)J2游第65nt处，长约2kb，为主要的结构基因编码区，其编码的氨基酸为660个，第5"--'22位为信号肽序列。第5159"～5213nt为一疏水区，含潜在的裂解位点，与HEV颗粒的形态形成有关。第5214"---5514nt序列编码一段富含精氨酸／脯氨酸，约有100个氨基酸组成的多肽，其中精氨酸占总氨基酸量的10％以上，可能是HEV的衣壳蛋白。HEV的抗原表位位于pORF2和pORF3上，ORF2编码的结构蛋白含有6个抗原结构域，分别位于氨基酸12"～147，143122，221"一373，381"-'504，490"--'579，573--一660。其中具有的抗原表位分别为6、2、6、5、2、5个【38】。ORF3含有369个核苷酸，与ORFl轻度重叠(Int)，与ORF2广泛重叠(328nt)，编码产物为磷蛋白，与细胞的支架及HEV型异性免疫活性有关。ORF3的起始端含Met密码子，可独立编码多肽，其中至少有4个抗原表位，可能为型特异性抗原表位[39】o最近研究发现，ORF2中与ORF3重叠的部分基因序列为ORF2中最保守部分，但该区所编码的蛋白质片段变异性最大。推测该部分基因序列可能折叠形成一较强的次级结构，从而抑制了核酸序列的变异。目前，临床上用于检测血清抗．HEV抗体及对HEV疫苗的研制多是围绕ORF2和ORF3而设计。10 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展176tORFiii0茹≮methytransrerasP‘i-i一；；i二-heicBs言■_-豫F3■■_rdomaino；o爿domain0筹2-．．．●papan—Iikepro'ceasepoly-prolimhir,ge,．‘-_oo函o--RH只-directedRHRpolymeraseLegend**一CDSI—gener广r广rrml]一iBBO-2088-⋯图2．2HEV基因组结构图methytransferase甲基转移酶，papain-likeprotease木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，HelicaseRNA解旋酶，ReplicaseRNA依赖的RNA聚合酶5．2编码蛋白HEV基因I--一III型和Ⅳ型的ORFS编码的蛋白产物大小不同，基因Ⅳ型ORFl、ORF2和ORF3编码蛋白长度分别为1707aa、672aa和123aa,基因I～Ⅲ型分别是1693aa、660aa和l12aa。基因Ⅳ型ORF2和ORF3多肽氨基酸明显不同，但通过计算机分析显示，改变后的ORF2和ORF3仍有完整的信号肽，说明虽然基因结构发生了改变，但仍能保证其正常的功能【401。5．2．1ORFl编码蛋白(pORFl)Panda等构建了一个含全长HEV基因组的cDNA克隆，以经体外转录得到的RNA转染HepG2细胞，观察到pORFl被加工为各结构域特异的产物，分别对应于甲基转移酶、RNA解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶等。ORFl编码蛋白大多与病毒RNA的复制有关，pORFl氨基酸序列所含的多种功能性结构域从N断到C端分别是病毒甲基转移酶，功能未知的Y结构域，木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，富含脯氨酸的“绞链”结构域，功能未知的X结构域，RNA解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶。pORFl中的甲基转移酶结构域的存在提示HEV基因组RNA具有57帽子结构，此已被证实【41’42]。重组HEV基因组的体内感染实验表明，HEV基因组的5'm7G帽子结构是HEV保持活力和感染性所必须的。Magden等也证实在昆虫细胞中表达的pORFl其活性可被帽结构类似物抑制【431。这为抗病毒药物的研制提供了理想的靶向。RNA依赖性RNA聚合酶可与基因组RNA37端特异性结合，从而指导互补链RNA的合成，基因组RNA3’端的两个茎环结构SLl和SL2以及poly(A),靛特异结合所必须的L44J。ORFl第2011"～2325nt为HEV相对高变区，编码约为lOOaa，由于ORFl编码的蛋白不在病毒表面，并不需要不断的改变以逃避宿主免疫系统的压力，该高变区可能 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染与HEV重要功能基因相对稳定，而不重要的基因区高度突变以适应病毒的生存和进化有关。5．2．2ORF2编码蛋白(pORF2)ORF2为主要的结构基因编码区，pORF2分子量约为75kD。对pORF2氨基酸序列的分析显示其具有典型的病毒衣壳蛋白特征14引，即在N端起始密码子之后，由l8个疏水性氨基酸(5---'22aa)构成典型的信号肽序列和一个富含碱性氨基酸(22"---322aa)的衣壳样区域。并含有潜在的切割位点(PA／PPP)，这与HEV颗粒的形成有关。在22～322aa之间有一段富含精氨酸／脯氨酸的多肽，其中精氨酸占总氨基酸量的10％以上，这使pORF2前半段高电荷。高电荷的衣壳蛋白在基因组转录本组装入衣壳的过程中可起到有效中和RNA所带负电荷的作用。Surjit利用酵母三杂交系统以证实。ORF2蛋白能与基因组5’端特异性结合，当ORF2N端缺失超过110aa时，这种结合活性完全丧失【461。Zafrullah等【47】通过对HEVORF2蛋白糖基化的分析，认为在哺乳动物细胞中表达的pORF2首先被合成82KD的前体，之后被切除信号加工为74kD的pORF2，最后进一步糖基化加工成88KD的成熟蛋白(gpoRF2)。Jameel[48】等用猴肾细胞表达ORF2发现，pORF2同时存在于细胞表面和细胞浆中，免疫印迹定出74kD、82KD和88KD三条蛋白带。pORF2借助N端内质网转运信号序列，以共翻译转运方式进入内质网，在其中糖化，并可能不经过高尔基而直接转运到细胞表面，在细胞表面，pORF2聚集于某些局部区域，pORF2可通过非共价作用形成同源二聚体，提示pORF2蛋白亚单位可能相互作用组装成高级结构形式。Robinson等【49】在昆虫细胞中表达pORF2，获得30kD'---100kD不等的多种蛋白产物，其中表达量较高的蛋白分别是72kD、63kD、56kD和53kD，后三者的N端均对应于pORF2全长的第112aa，而C端不同。其中pORF253kD可组装成病毒样颗粒(VLP)，是T=I的二十面体对称【501。对其进行研究在HEV诊断和疫苗研制中具有重要意义。pORF2上抗原表位数量多，结构复杂，除N端25--一38aa外，大多数分布在C端2／3部分。1992年Kaur川定位了pORF225"～38，341"一354，517"---530aa，3个抗原活性区，Khudyakov等1993年定位了319"--'340，422,--一437，631"---648，641～660aa，4个抗原活性区，1994年又发现在390"～470和546"---580aa上还有两个抗原决定簇区域，进一步深入研究证实在394-～470aa之间至少含有5个不同，免疫活性的抗原表位【52】。Li等【53】在大肠杆菌中表达了不同区段的GST-ORF2融合蛋白，发现两个构象表位，分别由N端17％的序列和C端40％的序列组成，GST-ORF2．3(1----1lOaa)代表的构象表位与急性期血清IgG和IgM有关，GST-ORF2．1(394"一660aa)内存在恢复期血清IgG抗体构象表位。ORF2全长编码的GST-ORF2蛋白只与急性期血清反应而无恢复期血清的反应性，推测由于肽链的折叠，基因表达的ORF2全长蛋白其C端的抗原表位被遮盖，而切去N端部分肽的ORF2抗原性很好。Purdy等【54J在研究大肠杆12 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展菌表达的HEV-郇E融合蛋白C2(24"--660aa)时，也指出ORF2蛋白C端2／3的部分其抗原表位与高级结构有关。Meng[55]等在此基础上首先发现并确定ORF2编码蛋白的C末端452"-617aa存在中和抗原表位，Schofield[56,571等用黑猩猩抗HEV抗体建立了噬菌体展示库，用两种ORF2重组蛋白抗原对此库进行筛选，确定了中和抗原表位在ORF2的C端。5．2．3ORF3编码的蛋白(pORF3)ORF3编码产物为磷酸化蛋白，分子量大约14kD，其N端含有两个疏水结构域，16--一32aa和7-、,62aa，pORF3通过第一疏水区与细胞骨架结合，定位在核支架和膜支架部位；磷酸化修饰位点位于相对保守的第80位Ser残基上。其主要功能不明。一些研究者把pORF3看作是结构蛋白，但也有人认为没有可靠证据提示pORF3作为结构蛋白存在。Tyagi等【58】利用荧光共定位技术，酵母双杂交实验，免疫沉淀实验和无细胞系体外转录．翻译技术证实。ORF3和ORF2可以相互作用，并且ORF3(57一-81aa)的26个氨基酸和Ser-80残基的磷酸化是必须的。在COS．1细胞中共表达的磷酸化的ORF3优先与非糖基化的ORF2相互作用，ORF3在基因组中的位置和ORF2的相互作用提示在病毒结构组装中有很好的调节作用。pORF3中含有多种蛋白激酶的识别序列，体外磷酸化实验表明，pORF3可被促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化，进一步研究显示pORF3是一种与细胞信号调变有关的病毒调控蛋白，是胞外信号调节激酶(ERK)和应激活化蛋白激酶C—JunN端激酶等MAPK超家族激酶的底物，提示其在HEV感染的细胞信号传导途径中的重要作用。Qi等运用化学固相多肽合成法合成了HEVORF3编码蛋白的不同区段，分析发现其抗原位点分布在第91--一123aa残基之间，此区段亲水性强，并有p一转角和折叠。Semiletov也证实ORF3第91～119之间包含一个免疫应答区。Khudyakovl591通过人工合成肽的方法发现，在ORF3蛋白的第91---一，119之间的肽段包含有一个免疫应答区，比较缅甸株与墨西哥株ORF3抗原性差异发现，缅甸株ORF3蛋白最强的免疫反应在第112～117aa之间，而墨西哥株在112～123aa之问，两株病毒问呈现出很大的差异，血清学试验证实，缅甸株ORF3重组抗原与被墨西哥株HEV感染的猕猴血清不起反应，根据墨西哥株91～123aa序列合成的多肽与缅甸株相应区域合成的多肽无抗体交叉反应。毕胜利等[601证实ORF3至少有4个抗原表位，可能为型特异性抗原表位。这些实验结果进一步印证了ORF3编码蛋白可能主宰HEV病毒株型特异性的论断。由于ORF3第80aa之后的多肽在各病毒株问差异很大，推测这些抗原蛋白很可能分布在病毒表面，决定HEV病毒株的特异性。ORF3编码的蛋白主要参与产生急性期血清HEVIgG。李凡，庄辉等用大肠杆菌表达ORF3全长蛋白，发现其对急性期血清呈强阳性反应，但随着病程的延长阳性率 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染下降。如果利用不同型ORF3作诊断试剂，不但可以准确检查出HEV基因型，而且对诊断急性戊肝有意义。5．3基因型5．3．1基因型分类传统上根据HEV各分离株之间的遗传距离将HEV分为两个基因型，即亚洲一非洲型和墨西哥基因型。1998年后分离鉴定的美国株US．1和US．2及猪HEV株被认为是一新的基因型。这三种主要基因型分别被称为基因型l，基因型2，基因型3。随着HEV不断被分离、克隆和鉴定，新的基因型和亚型也不断出现，目前根据HEV各分离株核苷酸，氨基酸同源性的大小及系统进化树分析，将目前世界上已发现的HEV分为8个基因型。①基因型1即缅甸类似株群，以缅甸株为代表，包括中国的新疆株，缅甸株，巴基斯坦株，吉尔吉斯坦株，印度株和非洲株。各HEV分离株总的核苷酸同源性都在92％以上，遗传距离为0．0120～0．0850。Arankalle等又将此型分为4个亚型，即A，B，C，D亚型。A包括大部分印度株，缅甸株和尼泊尔株。B包括中国新疆株，巴基斯坦株，前苏联株和两个印度株，C包括非洲各株，D包括3个印度株。②基因型2(原称基因型2罗马)代表株为墨西哥株，与基因型l株之间的核苷酸同源性小于76．1％，遗传距离大于0．3053。Buisson等对从尼日尔分离的7个HEV毒株进行序列分析，显示其与墨西哥株最为接近。ORFl和ORF2核苷酸的同源性分别为87％和80％，提示其可能是基因2型中的一个亚型。③基因型3包括分离自美国的HEVUS．1，US．2及猪HEV株。此型各株与缅甸类似株和墨西哥株之间的核苷酸同源性小于74．3％，遗传距离大于0．3295。US一1和US．2之间的遗传距离为0．0805，在核苷酸和氨基酸水平上，3株问的同源性分别为92％和98％～99％。④基因型4包括分离自中国台湾，北京，辽宁，广州，厦门等地的HEV株，目前划归基因型4．中国型。早在1995年huang等人就发现广州分离的两株HEVG．9和G一20的部分核苷酸序列与缅甸株，墨西哥株差异较大，近年来又从中国的台湾、厦门等地戊型肝炎患者中分离到不同于中国新疆株的毒株，经过不完全序列分析，提示这些分离株属于另一种基因型，Wang等对来自中国北京，辽宁，河南等地的HEV患者测定了15个HEV序列，结果9株与缅甸株同源性粒高，可以归人基因型l，而另外6株则与缅甸株差别较大，种系、遗传树分析这6株代表新的基因型(即基因型4)。研究提示此型可能在中国急性戊型肝炎患者分辨样品中分离的一株HEV进行全序列分析，进一步证实其属于基因型4，这些瓶的中国分离株与Heieh等测定分离自台湾 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展的一株HEV部分ORFl核苷酸同源性在87％----89．3％，提示台湾株亦属于基因型4。⑤基因型5主要有意大利分离株，对最近分离的意大利株HEV进行系统进化树分析，属于一独立分支，证实为新的基因型。意大利株ORE2与缅甸株，墨西哥株，美国各株之问核苷酸同源性分别为：83．3％、79．7％和87．7％。⑥基因型6和基因型7分别包括希腊分离株I和希腊分离株2，其ORFl，ORF2同源性分别为84．4％和87．2％【361，利用种系遗传树分析而确定为新的基因型，它们与缅甸株，墨西哥株，意大利株的核苷酸同源性在76．3％一-'86．8％。另外，有学者将阿根廷株划为基因型8，其理由是该国无旅行史的急性肝炎患者粪便样品中扩增得到部分HEV基因，对其ORFl和ORF2进行不完全序列分析，结果表明其与以往的任何分离株都有很大差异。⑦基因型8有学者将阿根廷株划为基因型8，因为从该国无旅行史的急性肝炎患者粪便样品中扩增到2株HEV。其ORFl和ORF2部分序列分析表明，ORFl与缅甸类似株，墨西哥株、意大利株、希腊1、2核苷酸同源性均低于85％，在基因进化树上另立一支。在这几个基因型之问，以基因型l最为保守，其各株问ORFl，ORF2氨基酸同源性都在91．2％以上。基因型l各株和墨西哥株ORFl的氨基酸同源性在93．5％"--'95．1％。希腊株，意大利株，美国株之间ORFl和ORF2核苷酸的同源性分别为81．9％～86．8％和82．4％～87．8％。对HEV基因型的研究显示如下特点：①不同基因型间遗传距离相差较大；②来自同一地区的HEV序列相对保守；③分离自非流行区的毒株与分离自流行区的毒株不同；④不同基因型的各株在氨基酸水平相对保守，这支持HEV只存在一个血清型的假设。5．3．2HEV基因型研究的意义目前HEV分型尚无统一的标准，对基因型的分类也存在分歧，但其研究具有重要意义。首先，可以加强对HEV起源及进化的认识，例如尼日利亚株同时具备基因型1和基因型2的某些特征，提示在非洲两种基因型同时存在，这可能为非洲与拉丁美洲的HEV毒株之间建立某种联系，以进一步研究HEV的进化与起源。其次，有助于分析戊型肝炎在全球范围内的地理分布特征。不同地域新的HEV分离株的发现并不意味着HEV流行，其重要性在于区分输入性肝炎和地方性肝炎，并对非旅行者急性肝炎加以重视。再次，了解基因异质性与抗原异质性之间的关系，可以考虑建立不同基因型HEV感染的检测方法，提高检测特异性，进而避免因抗体特异性减弱或降低而导致误诊。最后，鉴于HEV存在猪．人之间的交叉感染，因此加强对猪及其它动物HEV相关抗体检测或HEV序列分析有助于鉴定和追踪传染源，确定人畜共患关系。综合分析目前所有毒株变异情况，尚未发现HEV基因内部特征与HEV在人体或 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染动物体内的毒力有关，提示戊型肝炎单价疫苗研制的可行性。利用这一特性可以指导戊型肝炎通用疫苗的研究。6戊型肝炎病毒的疫苗研究进展由于HEV在细胞培养中不易生长，已有的疫苗研究主要采用分子生物学手段，一方面是HEV编码区开放性读码框架(ORFs)中ORF2和ORF3序列的重组表达，血清学研究发现，ORF3编码蛋白的抗体主要在感染急性期出现，毒株特异性较大，因此HEN重组蛋白疫苗研究主要针对ORF2编码蛋白，它的几个免疫活性的抗原决定基已被确定【61．621，并在多种单核和真核系统中表达；另一方面是HEV基因的DNA免疫，主要是ORF2序列的重组质粒免疫。6．1大肠杆菌表达的重组蛋白或者抗原肽大肠杆菌(E．coil)表达系统是传统的原核表达系统，具有技术成熟、表达量大、速度快、培养条件和过程简单、成本低等优点，已被用于表达了HEV的ORF2基因的不同片段，产物免疫原性较好。但由于该系统不能对蛋白进行加工修饰，产物的活性有待进一步提高。1993年，Purdy等163]用E．coil中表达HEN缅甸株ORF2片段，产物是436aa的融合蛋白(TrpE．C2)，它能对被同源毒株攻击的猕猴提供保护作用，这是HEV重组蛋白免疫原性的最早研究之一，为戊肝疫苗研究奠定了基础。ImSW等晔J在E．coil中表达HEV中国株ORF2的3’端附近的区域，产物是23lkDa短肽(pE2)，它能自发形成同源二聚体，免疫3只恒河猴后，用同源毒株攻击，两只猴不感染，1只猴有少量病毒分泌，表明pE2能对被同源毒株攻击的恒河猴提供保护作用，推测同源二聚体能更好模拟ORF2编码蛋白的免疫原性部位的3级结构。何志强等【65】用Ecoil表达ORF2中394～606aa片段(NE2)的3个N端延伸突变体，发现对应于ORF2的368,--606aa的重组蛋白HEV239在体外可以形成颗粒性抗原，透射电镜和原子力显微镜观察均见直径约为15"-'-'30nln的颗粒，将该HEV239抗原颗粒与戊肝患者血清、中和性单克隆抗体反应。以及免疫Balb／C小鼠后观察ED50，结果显示它具有比NE2更好的抗原性和免疫原性。还有学者分别在E．coil表达ORF2中224----．660aa[6倒、112～607aa!F71段蛋白，产物均具有良好的免疫原性，为戊肝提供了更多候选疫苗。6．2杆状病毒．昆虫细胞系统表达的重组蛋白杆状病毒一昆虫细胞表达系统是近年应用广泛的真核表达系统，具有翻译后加工功能，表达产物成为自主性的、有功能的蛋白。免疫原性好；表达水平高，能同时表达16 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展多个外源基因，至今已有多个HEV基因片段经该系统得到表达，产物具有良好的免疫原性，已有1个候选疫苗通过了I期试验。但产物的应用也受到了异源昆虫蛋白的限制。YarboughtPO等【68J将昆虫细胞表达的HEV缅甸株ORF2基因片段产物(r62K)黏膜内注射免疫3只猕猴，用异源墨西哥株攻击，两猴不发病也未见感染，另1只猴出现迟发感染及粪便RNA短暂阳性，表明HEV的复制被抑制了，r62K对异源毒株攻击的猕猴有保护作用。这是在昆虫细胞表达HEN基因的较早研究。LiTC等【69】在昆虫细胞表达的HEV缅甸株ORF2基因片段产物(50kDa)分泌入培养基后能自我组装成为病毒样颗粒(VLPs)，VLP与HEV野生型毒株相似但体积稍小，能口服免疫。用VLPs口服免疫的小鼠出现血清IgM、IgG、IgA和粪便IgA反应，表明诱导了系统和肠道抗体反应；Western—Blot和抗原包被ELISA实验证实，产生的血清IgG和粪便IgA均与同源HEV反应。用VLP口服免疫的两只猕猴出现血清IgM、IgG、IgA反应；被静脉注射同源HEV攻击，两猴均不发病，1只猴粪便排泄病毒3d。以上表明，VLP的免疫原性好，并能口服免疫，是很有前景的戊肝候选疫苗。VLP还能用作口服免疫载体分子，在其3’端整合1个长度为llaa的B细胞抗原表位，成为嵌合VLP，其形态特征与HEV病毒体相似；能与整合的B细胞抗原表位的单克隆抗体反应，表明该抗原表位在VLP表面；口服免疫小鼠，诱导出HEV抗原和B细胞抗原表位的特异性肠道免疫和体液免疫。VLP还可作为外源基因口服免疫的携带者，用于DNA免疫和基因治疗，在体外将HEV包膜基因的eDNA包装进入VLP，经口服免疫后诱导了HEV特异的肠道、体液及细胞免疫。到目前为止，已有1个HEV候选疫苗通过了I期试验，该候选疫苗是昆虫细胞表达的HEV巴基斯坦株ORF2片段的蛋白产物(56kDa)，经黏膜内注射免疫八只猕猴后用同源株攻击，所有猕猴均未发病，部分猴粪便分泌病毒。0．499'--'501xg范围内4种不同剂量连续两次(每月1次)黏膜内注射免疫6只恒河猴，结果显示，免疫剂量和诱发产生的抗体滴度成正相关；用同源和异源性毒株攻击后，所有动物均未患肝炎，但许多动物有病毒血症和粪便排毒，这很可能是攻击病毒的剂量太大所致【70】。研究第3次剂量的使用与否和两次剂量的保护期，结果显示，第3次剂量能提高免疫力，保护期持续至少6个月【7lJ。临床前试验显示，该疫苗免疫的猕猴能抵抗3种不同基因型的HEV毒株的攻击，获得最佳保护需要两次剂量【721。用l5、20、401xg4种配方免疫志愿者，l嵋配方免疫原性不高，其他配方在健康志愿者体内引起的HEV血清抗体阳转率在88．9％～95％之问。该疫苗目前在尼泊尔进行II期和ⅡI期试验。国内学者也进行了昆虫细胞表达HEV基因的研究。杜瑞娟等【73】表达了HEVORF2基因的3’端1290bp的片段，经免疫荧光、Western—Blot、动物免疫试验证实该重组蛋白可刺激机体产生抗HEV抗体。张明程等【‘741表达HEV全长ORF2基因，经 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染SDS．PAGE、Western—Blot及免疫荧光证实了重组蛋白的表达及活性。6．3酵母表达系统表达的重组蛋白酵母表达系统营养要求低，能高密度发酵培养；条件易于控制，利于规模化实施和生产：对表达的蛋白进行翻译后修饰，产物类似天然蛋白，生物活性高，也易于纯化，因此是较有前景的疫苗开发工具。一些学者进行了用酵母表达系统表达HEV基因的探索，为戊肝疫苗的研制提供了新途径。“H．zll等[751用一段柔性的甘氨酸铰链将HEVORF2第551"-一607aa基因片段与HBV的表面抗原HBsAg基因融合，在甲醇营养型酵母胞内表达，产物经WesternBlot、ELISA、CsCl浓度梯度分析、电子显微镜观察显示，分子量为32kDa，能组装成HBV／HEV嵌合病毒样颗粒(VLPs)，免疫学、物理及形态特征均与HBsAg颗粒相似；嵌合VLP与HBV和HEV阳性血清反应性均强，具有天然HBV／HEV双重抗原性。推测嵌合VLP能给表面展示出的HEV抗原提供良好的免疫原性，可能作为HBV／HEV重组2价候选疫苗。佟玉品等【_76J利用甲醇营养型酵母表达了编码HEVORF2第69～660aa的基因，得到分子量为59kD的重组蛋白，经亲和捕获反应转录PCR、免疫小鼠实验表明，该重组蛋白刺激小鼠产生的抗体，不仅可以特异性结合天然HEV，而且在小鼠体内可有效地诱发体液免疫反应，具有良好的免疫原性。6．4转基因植物表达的重组蛋白转基因植物疫苗具有许多潜在的优势，生产简单，成本低，易推广；产物三维空间结构趋于自然状态，免疫原性和生物活性高，能成功地诱导黏膜免疫反应；安全性好；贮存简单，不污染环境。但也存在一些问题：表达量不高，口服时易被消化。MaY等r7。7】将ORF2部分序列f命名为HEV-E2基因，编码394"～604aa)转入西红柿基因以研制HEV转基因植物口服疫苗，他们构建了该HEV部分抗原的植物表达载体并转染西红柿基因，ELISA试验显示，在转基因西红柿果肉组织中低水平表达出有特异抗原性的HEV-E2蛋白。植物作为生产戊肝疫苗的新型反应器，也具有较大的研究价值。6．5重组腺病毒免疫腺病毒作为疫苗载体在诱导黏膜免疫方面具有明显的优势，可模仿病毒天然的感染方式，并直接在体内表达天然的、保持完整生物活性的抗原蛋白，因此常常能诱导有效的特异性黏膜和体液免疫应答。董雪等[781进行了重组腺病毒表达HEV基因的尝18 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展试，他们构建出能表达HEV的ORF2中112～660aa段蛋白的重组腺病毒Adasy—EORF2，经鼻腔免疫小鼠后可刺激机体产生特异性[gA、IgG免疫应答，IgG最高滴度达1：1000：经腹腔免疫可刺激小鼠产IgG免疫应答，最高滴度可达1：10000，未检测到明显的]gA应答，表明能表达HEV的ORF2蛋白的重组腺病毒能刺激机体产生有效的免疫应答，为戊肝疫苗研究探索了又一新途径。6．6DNA免疫DNA免疫是近年发展起来的新型免疫手段，可同时诱发机体免疫产生特异的体液和细胞免疫，性质稳定。制备简单。DNA免疫已用于HEV疫苗的研究，将含有HEV基因序列的真核表达质粒DNA直接免疫机体，这与自然感染相似，可由肝细胞表达出天然形状的抗原，从而诱导机体产生特异免疫反应。HeJ等【79】将构建的含有HEVORF2全序列的质粒pJHEV注射免疫小鼠后，在比HEV常见潜伏期更短的时间内诱导产生了高水平的血清IgG，推测这种DNA疫苗可被用作感染后免疫。KamiliS等瞪oJ用构建的含有HEV缅甸株ORF2全长序列的表达载体黏膜免疫四只猕猴，均被诱导出抗一HEV抗体反应。但体液免疫微弱，重复免疫后抗体水平未见增强，在异源毒株攻击后只有两只猴不感染。最近，他们用基因枪将这种DNA疫苗免疫猕猴。其对异源毒株的攻击表现保护作用，表明免疫原性增强了。吕冬梅等【8l】构建了含有HEVORF2的3’大片段和369bpORF3的完整片段的质粒DNA：pcE2和pcE3，免疫Swiss小鼠，ELISA显示该重组质粒DNA诱导了小鼠的体液免疫。7猪戊型肝炎病毒的动物模型7．1非人灵长类动物1983年Balayan等应用免疫电镜(IEM)从ET-NANBH病人的粪便中发现直径为27—30nm的圆形病毒样颗粒(VLPs)，用该患者的粪便悬液感染2只食蟹猴均发生肝炎，第1次建立了戊肝的动物模型【821。Kane等在尼泊尔的ET-NANBH患者的粪便中也证实有同样的VLPs存在，他们用ET-NANBH病人的粪便悬液(10％)给2只黑猩猩和4只野捕的髭狨猴(Saguinusmystar)分别每只静脉注射1．0mL和O．5mL。结果，3只狨猴的肝酶活性显著升高，通过IEM观察到1只急性期狨猴从粪便中排出直径约27nm的VLPs，并且在异柠檬酸脱氢酶升高前和高峰期内病毒排泄最多，在恢复期血清中可检出抗VLPs的抗体；而2只黑猩猩均未见肝功能杂乱而引起的生化异常，到第12周时对1只黑猩猩进行肝活检也未见肝实质损坏。这提示通过接种VLPs至少19 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染1种形式的NANBH流行，并证实Balayan发现的这种实验动物排出的VLPs与ET-NANBH患者粪便中的VLPs在形态学上相似。Bradley等应用来自缅甸和巴基斯坦的2种不同ET-NANBH患者的粪悬液接种到食蟹猴和髭狨猴(第l代人工感染动物)，然后用第1代感染动物的粪悬液接种到第2代动物，又用第2代动物的粪悬液接种到第3代动物食蟹猴。结果食蟹猴发病的潜伏期明显缩短，病情加重，在食蟹猴的第l一3代和狨猴的第1、2代的粪便中均发现有与人类粪悬液中相似的VLPs。随后，Vchida等用缅甸境内散发的ET-NANBH患者的粪便提取物接种4只食蟹猴，结果从第2周起血清丙氨酸转移酶(ALT)和天冬氨酸转移酶(AST)增高，与第3—4周达高峰。同时，在其胆汁的粪便中均查到VLPs，用其粪提取液接种第2代，结果食蟹猴均发生相同的急性肝炎。这说明食蟹猴是一种特别适宜于HEV研究的实验动物。Arankalle等采用8％的Abm．84株粪悬液0．5mL和10％的K01．81株粪悬液1．0mL分别接种2只黑猩猩，结果在接种后3～5周出现ALT呈轻度升高的肝炎，且都出现了能中和Ahm一84的抗体。急性期肝组织检查见小叶灶性坏死和其它细胞损伤，通过IEM进行血清学检查证实这种VLPs是印度ET-NANBH2次流行和1次散发以及前苏联1次ET-NBNAH流行的原因。1990年Reyes等从HEV感染的食蟹猴中成功的提取HEV-RNA，建立了eDNA文库，筛选出ETl．1cDNA克隆，是HE研究的又一里程碑。王光明等选用野捕的产于我国四川的15只1~3岁的猕猴进行HEV感染试验，采用新疆和沈阳戊肝病人的粪悬液感染2批动物。第1批感染4只，结果3只发生肝炎；第2批感染4只，对照组2只，结果前者于感染后4-6周均有ALT升高，肝活检呈典型急性肝炎病变，但临床特征不明显，仅个别猴表现为食欲不振或活动减少。接着，他们又对2组猕猴作2次传代。第1组应用第1代感染猴急性期粪便感染4只，另一组用第l代猴的肝悬液感1只，结果第1组有3只猴在感染后2～8周和12周其ALT升高：第2组于接种后第6周血清ALT升至1667(nmd／s)／L以上，感染后1周血清抗体转阳，IEM检查粪便中有大量的直径为27～34nm的VLPs[83,841。而后他们又选用7只猕猴进行第3代传代，结果5只猴发生戊型肝炎，肝活检见肝组织呈炎症和坏死病变嘲。非人灵长类动物感染入HEV后，表现与人极为相似的急性病毒性肝炎临床症状，因此被广泛用作研究HEV的实验动物模型。Balayan[86】等最早建立了经粪．口途径感染非人灵长类的实验模型。在野生猴血清中可检出HEV抗体。用人HEV实验感染猴时发现，其对外来HEV感染的免疫保护性随体内抗体滴度的增高而增强，表明在非人灵长类动物中有HEV或抗原性与人HEV相近的病原微生物传播和流行，但这些病原微生物是否与人HEV属于同一种属，二者是否会在人和非人灵长类动物之间交叉20 文献综述第二章猪戊型肝炎病毒研究进展传播，有待于进一步研究证实。7．2家猪早在1990年，Balayan掣871就以人HEV实验感染圈养猪，结果表明猪对人HEV是易感的。Clayson等【88】从尼泊尔圈养猪的血清中检测到特异性的HEV抗体，在粪便及血清中检测到人HEVIⅢA，证实猪也是HEV宿主。Meng掣89】分别检测了来自中国、泰国、朝鲜和加拿大四个国家不同地区养猪场的猪血清和部分国家地区的养猪场的饲养管理者的血清，发现HEV抗体的阳性率极高。中国的4月龄以上的猪的抗体阳性率平均为40％，而饲养员的阳性率高达100％；泰国3月龄以上的猪的阳性率为9％～20％，饲养员的阳性率为71％；朝鲜的1月龄以下的猪阳性率约5％，而6月龄及成年母猪的阳性率则高达60％：加拿大各养猪场的猪群中，HEV抗体的阳性率为O％～100％不等。这些检测结果再次说明，HEV在猪群中的分布和传播极为广泛。在美国和台湾地区分离到猪HEV，经测序和遗传种系分析发现，这些猪HEV核苷酸序列和当地居民感染的HEV具有高度的同源性。在种系发生树上，台湾地区人和猪HEV、美国地区人和猪HEV分别组成一个独立的分支，提示在同一地区人和猪HEV属于同一基因型。用猪HEV感染非人灵长类动物，则表现出急性HEV感染的临床表现，ALT升高，粪便中可检测到特异性HEVRNA，但ALT升高水平及临床症状明显轻于人HEV感染，表现为亚临床感染。同样，以猪HEV感染SPF猪也表现为亚临床感染。而有趣的是，将实验对照的猪与感染了人HEV或猪HEV的实验猪圈养在一起，对照组在实验组出现感染两周后也被HEV感染。这些结果再次表明，脏是一种入畜共患病。Meng等f90】用巴基斯坦株和墨西哥株静脉内接种SPF猪却未出现HEV感染临床表现和血清学变化，揭示猪对不同基因型或不同亚型HEV毒株的易感性可能有所不同。7．3啮齿动物Karetnyi等川和Maneerat等【921先后以人HEV实验感染大鼠，感染后大鼠并未表现病毒性肝炎的临床症状，但接种数天后，在内脏、淋巴结、肠细胞以及外周血单核细胞脑浆中都陆续检出HEV抗原，肝脏活检呈典型的炎症性病变，粪便中出现排毒现象，且多表现为亚临床感染。一些学者先后在尼泊尔的加德满都山区及美国各地的野生大鼠血清中检出HEV抗体，阳性率在28％"--90％之间。城镇地区大鼠血清中的HEV抗体阳性率明显高于边缘地区。赵素元等【93J用HEV人工感染疫区捕获的鼠和人工饲养繁殖成功草原兔尾鼠、子午沙鼠，证实对HEV易感。在疫区调查发现居民区2l 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染家鼠和野鼠的活动频率，迁徒规律与戊肝发病的高峰季节关系密切，鼠便污染食物和生活用品所致戊型肝炎的传播，已成为鼠传播戊肝的客观依据。子午沙鼠感染HEVl8d后粪便中HEVRNA阳性率为25％，并与酶学症和肝脏病变同步出现。7．4其它动物在其它动物中也发现有HEV感染和传播现象。用人HEV实验感染山羊，结果证实山羊对HEV易感。鸡和牛血清中也可检测到HEV抗体。Payne等194]对鸡巨肝脾病病毒(BLSV)进行部分序列分析并与人HEV的序列进行比较，发现其与人的螺旋酶基因具有62％同源性。提示二者在遗传学上相关，这些结果提示HEV在鸡、牛和羊中也普遍存在。到目前为止，已发现HEV在非人灵长类动物、猪、啮齿动物、牛、犬和鸡中有分布和传播。HEV感染这些动物后多表现为亚临床感染，这也可以解释为什么在很少发生HE流行的发达国家的健康人群中，既无黄疽肝炎病史，又否认到过任何HE流行疫区，血清中抗HEV抗体阳性率却很高。自然界中多种HEV动物宿主的发现，对HE流行病学的研究及理想的动物模型选择有重大实用价值。随着异体器官移植技术的发展，人类接受动物器官移植的频率越来越高，从而被感染上动物HEV的风险也越来越大。HEV动物宿主的发现对于移植器官的严格筛选、HE的传染源的控制、HEV传播途径的切断及HEV疫苗的研制均具有重大意义。 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试验研究第三章PCR检测江西猪群猪圆环病毒2型感染摘要：参考GenBmllIk已发表的PCV2基因序列，根据PCV2(AF027217)和PCVl(U49186)全基因序列设计合成一对引物进行PCR扩增，扩增出大小约1154bp的目的片段，建立了检测猪病料中的PCV2方法。采用该建立的PCR方法对江西部分市县猪场的133份拟似病料进行PCV2检测，结果表明7l份病料为PCV2阳性，阳性率为53．38％，证实江西省部分市县的猪场PCV2感染较普遍。PCV2亚型检测PCV2b阳性率为61．6％，PCV2a阳性率为4．5％，江西省猪群PCV2感染是以PCV2b为主。关键词：猪圆环病毒2型；感染；PCR；检测猪园环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)为无囊膜的单股负链DNA病毒，属圆环病毒科(Circoviridae)成员【1】。许多国家有不断发生猪园环病毒病的报告，这一疫病现己证实是世界各地一种可造成严重损失的猪的传染病。PCV2感染和引起的疾病己成为全球养猪生产中的一大问题，自2006年“高致病性猪蓝耳病”发生和流行以来，该病对我省乃至全国均造成较大经济损失，由PCV2引起的疫病在临床上常常可见。本试验旨在建立快速、准确的PCV2检测方法，通过对临床发病和死亡病例猪样本检测，了解掌握江西猪群PCV2的实际感染情况，为猪病的预防和控制提供基础。l材料与方法1．1材料1．1．1病料来源对2006年来自江西南昌、高安、宜春、上饶、景德镇等多个市县送检的133份疑似感染PMWS病猪的肾脏、脾脏、淋巴结等脏器，冷冻运送，．20℃保存备用。阳性参考为本实验室已鉴定的毒株。1．1．2酶和其他试剂PCR扩增试剂盒、饱和酚、胃蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB购自上海生工，氯仿、无水乙醇、异戊醇、醋酸钠等其它试剂均为分析纯试剂，DNAMarkerDL2，000购自大连宝生物公司。 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染1．1．3引物设计及合成根据已发表的PCV-2核酸全序列【2】(AF027217)和PCV-1核酸全序列(U49186)，利用计算机辅助软件Oli904．0设计了l对PCV-2特异性的PCR引物，扩增长度为1154bp。由上海生工生物有限公司合成。用前溶解于灭菌的TEQH8．O)中，稀释至浓度为20pmol／L，一20℃分装保存。上游PWI：5’>CCGCGGGCTGGCTGAACTT<3’下游PW2：5’>ACCCCCGCCACCGCl’ACC<3’。扩增的DNA片段长度为1154bp。1．1．4主要溶液的配制参照文献【3】1．1．5主要仪器设备超纯水机，高速台式离心机，PCR扩增仪，Nichipet微量加样器，全自动数码成像及分析系统，无菌操作台，自动双蒸水蒸馏器。1．2方法1．2．1组织匀浆及PCV2DNA的提取将采集的病猪肾脏、脾脏、淋巴结各取少量放入玻璃匀浆器中，往其中加入lmL的PBS液匀浆，将匀浆液倒入1．5mLEP管中放入离心机中8000r／min离心5min，弃上清，在该EP管中加入500}tlDNA消化缓冲液和51xl蛋白酶K(20mg／mL)，37。C水浴30min，加入500I_tl酚．氯仿．异戊醇(体积比为25：24：1)，混匀，震荡，10000r／min离心15min，取上清液转移到新的已灭菌离心管中，加入1／10体积的醋酸钠和2．5倍无水乙醇，上下倒置混匀，12000r／min离心5min，弃上清，用75％乙醇洗涤，12000r／min离心5min，弃上清，此操作重复一次，无菌吹干，加入409l灭菌双蒸水或TE溶液，一20℃保存备用或立即使用。‘1．2．2PCR反应(1)按下列组成配制PCR反应液10×PCRBuffer1．51xLddH2010．4LLLMgCl2(25Mm)1．5uLDNTPs(10Mm)0．3uLTaqDNA聚合酶0．2血PWl(20pmol／BL)0．3MlPW2(20pmol／gL)0．3gLDNA模板0．5血Total151．tL30 试验研究第三章PCR检测江西猪群猪圆环病毒2型感染将上述反应液加入到PCR反应管中，轻轻混匀。(2)反应条件：94℃预变性12min；然后94℃45s、55℃45s、72℃lmin，扩增35个循环；最后一个循环结束后72℃延伸10min。反应在基因扩增仪(PE9600)上进行。1．2．3PCR产物鉴定配制l％琼脂糖凝胶，加入终浓度为0．5ug／mL的溴化乙锭(EB)。取89LPCR产物与上样缓冲液混合后加入加样孔，以1xTAE为缓冲液，紫外检测仪下观察结果。以PCR产物中出现1154bp条带的样品为阳性。2结果2．1不同区域来源的可疑病料PCV2感染的检测结果从PCV2阳性毒株中扩增出了1154bp的目的条带，用此PCR方法对133份临床组织病料进行了PCV2检测，结果从71份待检样品中扩增出了PCV21154bp的特异条带。部分PCR结果进行电泳，结果在1％琼脂糖胶上出现预计的条带(图1．1)为PCR产物阳性结果。图3．1部分猪病料PCR扩增结果Fig3-1PCRproductofpartialdiseasesamplesofswine1．DL2000Marker；2-9．阳性扩增产物；10．阳性对照；11．阴性对照1．DNALadderDL2000；2-9．PCRproductsoftissuesamples；10．Positivecontrol11．Negativecontrol从表3．1可以看出不同市县送检的133份可疑病料中有71份为PCV2阳性结果，阳性感染率为53．38％，其中有的市县送来的病料为阴性，有的市县送来的病料阳性率为100％。 表3．1不同区域来源的可疑病料PCV2感染的检测结果Table3-1PC—V2detectio—nresultsofspecimenssampledfromdifferentareas_—_病料来源送检病料数阳性数阳性率(％)———(S—p—ec—im—ens—source)(Samplenumber)(Positiverate)一新干(Xingan)1横峰(Hengfeng)3j安义(Anyi)84新建(Xinjian)1412新余(Xinyu)6z宜车(Yifeng)54宜春(Yichun)7j万年(Wannian)158抚州(Fuzhou)3z上高(Shanggao)218高安(Gao‘an)82万载(Wanzai)1O53．38宁都(Ningdu)2‘景德镇(Jingdezhen)2吉安(Ji‘an)53恒湖(Henghu)42幽兰(Youlan)3樟树(Zhangshu)42上饶(Shangrao)32弋阳(Yiyang)94南钢(Nangang)30吕邑(Changyi)3’0昌北(Changbei)3璺生!!翌!!。一133—71——2．2不同区域来源的可疑病料PCV2亚型感染的检测结果2008年7月到2009年12月，对来自南昌市、高安市、宜春市、上饶市和景德镇市等送检的235份疑似PcV2感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)进行PcV2a、PcV2b32 试验研究第三章PCR检测江西猪群猪圆环病毒2型感染亚型检测，结果如下：表3-2不同区域来源的可疑病料PCV2亚型感染的检测结果Table3—2PCV2subtypedetectionresultsofspecimenssampledfromdifferentareas．．．．．PCV2PCV2bPCV2aPCV2病料来源病料数阳性数未定亚型从表3—2可以看出，235份拟似感染病料PCV2检测有224份为阳性，在224份PCV2阳性病料中PCV2b为138份，PCV2b阳性率为61．6％，PCV2a为10份，PCV2a阳性率为4．5％。还有76份PCV2感染未定型。3讨论已有研究表明我国猪群中广泛存在PCV2感染。郎洪武等14]用ELISA方法检测来自北京、河北、山东、天津、吉林、河南等7省(市)22个猪群中共559份血清，结果检出的总阳性率为42．9％。王忠田、杨汉春等用PCR方法对我国北京、天津、河北、山东、山西、深圳、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行PCV2感染的流行病学调查，结果在55份组织病料中阳性检出率为96％，PCV2感染所造成的疾病主要是PMWS，并多伴有严重的继发感染，其次是PDNS。本试验从临床表现为发热、消瘦、黄疸，剖检变化为肺问质增宽，脾、淋巴结肿 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染大的病(死)猪，疑似猪圆环病毒感染的133份病猪的肾、脾和淋巴结，经过PCR检测PCV2，扩增出预期片段(并随机挑一个阳性DNA进行下面的全基因的扩增和测序)，从试验的结果可以分析江西地区PCV2的感染率比较高，达53．38％，有的市县送来的病料为阴性，有的市县送来的病料阳性率为100％。由于猪体内的PCV2病毒含量只有达到一定数量后才表现出临床症状，而且PCV2引发PMWS可能还需要其它致病因子的协同作用，所以感染PCV2猪可能呈隐性感染。本试验所得到的PCV2感染的总阳性率从检测数据(见表3．1)显示在江西猪圆环病毒感染严重并且流行范围很广，其发病率较之芦银华【5l等(33．3％)调查的高，比郎洪武N(2000)利用血清学检测得到的42．9％总阳性率要高，比戴益民【6】等(45％)调查的也有较大程度的提高，较谢俊斟71等对我国陕西和甘肃地区的调查(66％)低，比王忠田【8J等(2002)利用PCR检测方法得到的96％总阳性率要低。该结果与我国近年来的猪圆环病毒感染的监测结果基本相符，PCV2引起的PMWS迄今还没有有效的治疗方法。目前对该病的防控措施还主要停留在加强饲养管理、降低饲养密度、减少应激、控制进出人员和车辆、加强早期疑似感染猪的诊断、隔离、淘汰等方面。国内外对PCV的诊断技术进行了大量的研究，已建立了多种方法成功地检测PCV的抗原、抗体和核酸。由于我国是一个养猪大国，要更加重视对PCV感染。本研究对2008年7月到2009年12月来自南昌市、高安市、宜春市、上饶市和景德镇市等送检的235份疑似PCV2感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)进行PCV2a、PCV2b亚型检测，在224份PCV2阳性病料中PCV2b为138份，PCV2b阳性率为61．6％，PCV2a为10份，PCV2a阳性率为4．5％，还有76份PCV2感染未定型。说明目前江西猪群PCV2感染是以PCV2b为主。PCV2a比PCV2b更早流行，在2003年之]{]／PCV2a感染率高于PCV2b，然而随着时间的推移以PCV2b为主[91；76份病料PCV2未定亚型有待进一步研究。 试验研究第三章PCR检测江西猪群猪圆环病毒2型感染参考文献[1】陆承平．兽医微生物学(第四版)【C】．北京：中国农业出版社．2007．8，376．379．【2】戴益民，何后军，李红．猪圆环病毒2型江西毒株的全基因扩增与序列分析【J】．中国兽医杂志．2005．41(8)：10—12[3】张维铭．现代分子生物学实验手册[C】．北京：科学出版社，2003，80．87【4】郎洪武，王力，张广川，等．猪圆环病毒分离鉴定及断奶仔猪多系统衰弱综合症的诊断[J】．中国兽医科技，2001，31(3)：3-4。【5】芦银华，谈国蕾，陈德胜，等．猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及初步应用[J】．农业生物技术学报．2002，10(4)：415-416[6】戴益民，何后军，邓舜州．江西地方株猪圆环病毒感染的检测【J】．动物医学进展．2004，25(5)；9294【7】谢俊良，杨增岐，赵华，等．猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用【J】．中国动物检疫，2006，23(11)：33—34【8】王忠田，杨汉春，郭鑫．规模化猪场PCV2感染的流行病学调查【J】．中国兽医杂志．2002，38(10)：3-6．[9】A．K．Cheung，K．M．Lager,O．I．Kohutyuk，eta1．Detectionoftwoporcinecircovirustype2genotypicgroupsinUnitedStatesswineherds【J]．ArchVirol(2007)152：1035-104435 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染DetectionofPCV2FromSwineinJiangxiProvincebyPCRABSTRACT：ToestablishaPCRfordetectionofswinePCV2，apairofprimersWaSdesignedbasedonthecompletegenomicsequencesofPCV2(accession#AF027217)andPCV1(accessionj66U49186)publishedinGenBank．TheexpectedPCRproductfromtheprimersetwasaround154bpinsizewhendetectedbyargrosegelelectrophoresis．Atotalof133specimenssampledfromdiseasedordeadpigsfromdifferentpigfarmsinJiangxiweretestedbytheestablishedPCRforPCV2．Ofwhich，71werePCV2positive(53．38％1．ThefindingsindicatedthatPCV2infectionsinJiangxipigswereverycommon．KEYWORDS：PCV2；Polymerasechainreaction；Detection；Infection36 试验研究第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析摘要：根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)的全基因组序列，设计一对特异性引物，进行PCR扩增，将一个扩增产物连接到pUCm—Tvector上并克隆到大肠杆菌DH5tt中，得到一个阳性克隆，经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定，证明扩增出了PCV2目的片段。本试验分离株(JXPCV2)与国内外不同地域的PCV2全基因组序列的差异很小，同源性在94．2％～99．7％；进化树分析表明JXPCV2与其他10个PCV2分离株的亲缘关系较近，与浙江分离株(AY691169)的亲缘关系最近。关键词：猪圆环病毒2型；基因组；序列分析猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)为无囊膜的单股负链DNA病毒，属圆环病毒科(Circoviridae)成员。PCV2与猪群中发生的多种传染性疾病密切相关，如仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)ll】、猪皮炎与肾炎综合征(Porcinedermatitisandnephropathysyndrome，PDNS)、猪呼吸道综合征(Porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC)等【21。PMWS是一种以进行性消瘦和多系统病理损伤为主要特征的免疫抑制性疾病，主要发生在6～16周龄的断奶仔猪。该病在我国自2000年首次报道以来，已广泛流行于全国各省，威胁着我国的养猪业，并造成了巨大的经济损失【3。‘7I。1材料与方法1．1材料1．1．1主要试剂及试剂金B型质粒小样快速提取试剂盒购至购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；UNIQ．10柱式DNA胶回收试剂盒、PUCm．TVector购至上海生工生物工程有限公司；2XTaqPCRMasterMix，购自BiotekeCorporation：限制性内切酶PstI购自Fermentas。其它试剂主要为分析纯。1．1．2受体菌受体菌DH5ct由本实验室保存。37 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染1．2方法1．2．1感受态大肠杆菌DH5a的制备(CaCl2法)以无菌接种环取保存的受体菌EcoliDH5a于LB(1％TtyPtone，1％NaCI，0．5％YeastExtract，1．5％琼脂，pH7．2)平板表面划线涂布，同时也在含AMP(50ug／mL)的LB平板表面划线作对照，倒置平板于37℃培养过夜后挑生长良好的单菌落接种2．5mLLB肉汤，37℃过夜培养。转移2mL培养液至装有100mLLB肉汤的300mL锥形瓶中，37℃振荡培养2～3h(OD600=O．5—0．6)，取50mL菌液于50mL离心管内，49C，45009离心5min收集细胞，弃上清液。加入25mL预冷的100mmol／L甘油CaCl2溶液(50mMCaClz，10mMTris—HCl)重悬菌体，置冰浴30min。3000r／min离心10min，重悬菌体于1．5"--2mL预冷的CaCl2溶液中，后冰上放置，2009L分装至1．5mL离心管内，于一70℃保存备用。1．2．2PCV2全基因组的扩增1．2．2．1组织病料来源取部分经PCR检测PCV2阳性DNA进行全基因扩增。1．2．2．2PCV2全基因引物设计及合成根据GenBank中已发表的PCV2基因组全序列(登录号AF027217)，并参照近年来发表的PCV2全序列扩增引物，利用Oli906．0软件设计筛选一对全序列扩增引物，引物序列如下：上游PWl：5’>GTACCTTGTTGGAGAGCGGG<3‘下游PW2：：5>TCACAGCAGTAGACAGGTCA<3，引物从421bp处开始扩增，可扩增全长为1768bpPCV2基因组，引物由上海生工生物工程公司合成。用前溶解于灭菌的TE(pH8．0)中，稀释至浓度为25pmol／L，一20。C分装保存。1．2．2．3反应体系g旦婴巳里望皇坐垒坐殳坠坐2XTaqPCRMasterMix25I．tLddH20221xLPWl(25pmol／gL)1ULPW2(25pmol／l-tL)l此DNA模板luL’rotai501_LL将上述反应液加入到PCR反应管中，轻轻混匀。反应条件：94。C预变性2min；然后94。C45s、59。C45s、72。C2min，扩增30个循环：最后一个循环结束后72。C延伸10min。反应在PCR扩增仪(PE9600)上进行。38 试验研究第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析1．2．2．4PCR产物鉴定配制1％琼脂糖凝胶，加入终浓度为0．5ug／mL的溴化乙锭(EB)。取81aLPCR产物与上样缓冲液混合后加入加样孔，以lxTAE为缓冲液，紫外检测仪下观察结果。以PCR产物中出现1767bp条带的样品为阳性。(图4．1为PCV2全基因电泳图)bp20001000750500250100图4一l部分PCV2全基因PCR结果Fi94—1PCRproductofPCV一2completegenome1．DL2000Marker；2-5．PCRproductoftissuesample；6．postivecontrol1．2．2．5PCR产物的回收取PCR产物5011L，在1％的琼脂糖进行电泳，按照V-GeneBiotechnologyLimited的DNA琼脂糖回收试剂盒说明进行回收，胶回收步骤如下：①切割条带用干净的手术刀片从琼脂糖凝胶上切下DNA片段。尽可能地切除多余的凝胶以减少胶的量；②称凝胶重将切下的凝胶片放入一已知重量、无色、1．5--．2．0mL的离心管中，再称重；③固定凝胶按每4001xL／100mg的琼脂糖凝胶的比例加入BindingBuffer，将胶混合液放在50。C～60℃温育10min，或者直至胶片完全溶解，温育过程中，振荡2一'3min，以促进胶溶解；④将融化的胶溶液转移到套在2mL收集管内的UNIQ一10柱中，室温放置2min，8000r／min室温离心lmin；⑤取下UNIQ．10柱，倒掉收集管中的废液，将UNtQ．10柱放入同一收集管中，加入500ItLWashSolution，8000r／min室温离心lmin；⑥重复步骤⑤；⑦取下UNIQ．10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ一10柱放入同一收集管中，12ooo@室温离心lmin；⑨将UNIQ一10柱放入一新的1．5mLEP管中，在柱子膜中央加401．tLElutionBuffer，室温放置2min。⑨12000r／min室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于一20"C：取8此进行电泳检测。1．2．2．6连接反应体系在一个标准的10pL连接反应体系中，加入50ng(1)pUCm-T载体、0．2pmol的PCR产物、llaL10xligationBuffer和1此的T4DNAligase，其余用水补足，但在通常状况下，没有必要对PCR产物进行定量。反应按以下体系进行：39 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染堡Q望望Q望塑!垒翌Q型10×LigationBuffer1¨L50％PEGpUCm-T载体purifiedPCRproductSterilizedwaterlpL11．tL5pLlpLT4DNALigase1ULFinalVolume101-tl16～23℃连接1～2h后用于转化感受态大肠杆西。1．2．2．7转化试验(热激法)(1)一70"C保存的200此感受态细胞取出置于冰上解冻，解冻后轻轻振荡，将细胞均匀悬浮。加入51aL连接液，轻轻混匀。冰上放置30min。42。C水浴热激90s。冰上放置15～20min。(2)加4009LLB培养基，37。C200--一250r／min振荡培养lh。室温下4000r／min离心5min，用枪头吸掉400lxL上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。(3)将细菌涂布在预先用20¨L100mmol／LIPTG和100pL20mg／mLX—gal涂布的氨苄青霉素(Amp)平板上。(4)平板在37℃下正向放置1h以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。第二天(约12h)将出现转化菌落。1．3pUCm．T质粒的鉴定1．3．1质粒DNA的提取在Amp(50Ulag／mL)和X—gal的LB琼脂平板上挑取单个白色的转化菌落接种在10mLLB肉汤(含Amp50ug／mL)；37。C振荡培养20h，3000r／min离心15min。弃上清收集菌体，加入125此蔗糖溶液振荡混匀悬浮菌体，转至1．5mLEppendorf,管中冰浴10min，再加入25此溶菌酶(10mg／mL)振荡混匀冰浴5min，再加入25pL250mmol／LEDTA液振荡混匀冰浴5min，再加入125uLLysistriton液，室温作用至菌液变粘稠，12000r／min20min，收集上清；再以酚、酚：氯仿、氯仿抽提1~2次，吸上清液，同时加入1／10体积的3MpH4．2NaAc；加入2倍体积的预冷乙醇(一20"C)，一20。C作用过夜，12000dmin离心20min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，自然干燥，用30pLTE(pH8．0)溶解沉淀，然后加入l此10mg／mL的Rnase放入4"C冰箱过夜，取5pL进行电泳，然后放入．20℃冰箱中备用。 试验研究第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析1．3．2质粒DNA的酶切鉴定(转化子的鉴定)酶切反应体系如下：gQ望望Q堕堕兰迪Q型Water，nuclease—free39p,110Xbuffer5plDNA-vecter5p,lpstI1ulFinalVolume50pl1．3．3电泳鉴定pUCm．Tvector结构见附录，对PCV2全序列进行酶切图谱分析，选用PCV2全序列上不含酶切位点的限制性内切酶pstI酶切pUCm．Tvector的多克隆位点两端，特异性的将目的片段切下来，电泳结果表明，酶切产物的两个目的片段的大小与预期一致(图4—2和图4．3)。酶切产物与质粒DNA经1％琼脂糖凝胶电泳，并于紫外灯下观察酶切片段的大小。1．3．4重组质粒进行PCR鉴定bp20001000750500250100图4—2酶切及PCV2全基因电泳图Fig4-2PCRproductofPCV-2completgenomeandpstl．1．酶切：2．DL2000Marker；3．PCV-2samplel：．Plasmidproductdigestedbypstl；2．DL2000Marker；3．PCV2sampleproductdigestedbypstl4l 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染bp20001000750500250100图4-3质粒及酶切电泳图Fig4-3PlasmidandPlasmidproductdigestedbyPlasmidproductdigestedbypstI．1．质粒；2．DL2000Marker；3．酶切1．Plasmid；2．DL2000Marker；3．Plasmid1．3．5测序把上述鉴定的重组菌送上海生工生物工程公司。2序列的测定与分析采用PCR扩增及酶切鉴定仅存在PCV2感染的个体，DNA回收试剂盒回收，克隆，菌液送至上海生工，测序由上海生工完成。然后再进行序列拼接，得到完整的全基因组序列(长度为1767bp)。42 试验研究第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析16王12主18i2雩i301363辱2王唾8王S粤王60266172王，78王8唾1901961102生108王11哇生120王126王王32王i38王1哇粤1150115右1i521168i37哇iACCAGCGCAC矗AAAG_A盈Z(；GCTTCCGAAGATTGTTGGCGATTGTG舂AGAAAGAAAGCGAATG醵A6AAIGGTACC!z镀TTCAGAA舀T’rTATTGGAAG舀CC!GC：TAA】1TATe沿T!AC℃AAzGAzCTAC了TACCTTT]曙TCCTCAACTGCGGA矗GAATGCCA重GCCCrGATTT!A工TA王TAZACATGGTTG．AGGCC_TACGG工Te疆HGGT￡始AGTG_G『TAGATAGGTS舀LGGCAC王CCCCrGTATTCTGTAGAZCATTA鱼TAC墨TG舀冱AGrACCAGCGgrAAA工GGCTGCGGAAACGAAAG舀TTCG6CAe；CGAAGAAGCG医AeGAGCGCAA：BGGAGG(蠢A百_rGCAA矗C叠骶T矗G￡A矗CTGATTGGAGCzccTGGA=IG矗GCGGGCCGCGGGeTG＆A羁互mC舀CTGC袋＆矗CCcGTGGTG毳矗G矗A￡；_AG鱼暇GT懿GGCCCGCA=GTrGTCCCAGC：工Zaf：l葶f弱再f：；4AAz!TCCATATTAT王AGGGE；工ACACGGAZAZTGG薯C3ACATTGGA再懿AA了GAG矗AGGGCTGCTGTGGC既TCACCCT《；6：GT般TC矗AAGGTTGAArCTcA工ATCeG舀AGGCG6譬GGC￡掘GGGGCGGrGTCAGrGCG(了GT瞅GC蕊CCTCGGCAGCACCTCCcc舀舀CCACAC舀A舀毳G研GA矗舀磊TAcGGGAG暖TC强醯G=AGG：A舀GGACGAAC．A(：rC(：AAAZA舀AG罾GAAAzGG瞰T工C矗GCA&AATA矗矗G矗AT矗：fTGAGATCTCAAGAGTC鄹掼GAGCTGAAeTTZGzC搬GrGGG蔬A舀(；CAC：；江钌GGTT弧AGA芏CGATATCAT!CTGA王TAIE；誓矗GA矗GCTCTCCACGGAGGGAAATAAAjrrTAAGTGGGGGTGTAZTCCTGTTCCAGCAGTCAATA箭GGAGG￡矗!；匹GG!TT骰TAC再AATGATCGGGGAGCACAGAGCGTCATGTCCACTGCGGGAGTGGe；TGGACGAGTT(：TTCTCCGAAGTAZT+G舀CA磊CG毛i；沾CC∞GC矗GATGAAAGTGIkGe珏CCAe∞GGACT∞A舀AccCTGATG=菇C3TCAZTG搬GrCCAGCAAzeATTTATCGBAGAAGGG(；00CAACrG＆gTCI!G工CT!T矗AG直GTCG工A王舀LIATTGTA鼹CTCAT{：rAGG矗CAATGGo蓉国三AGGTTAT蹦CTGCAGG￡；0CAGGGGGTZzG_AGCGCCCAGGAGGCGGGT疆TGCC鱼G麟S四AACGCCTCCAGeAGCAZK：GGZGTTCACGe!CCCTTTTTCCrCCA=GGGGCGGrGCCCGCCAGTAAAGAATGACCTCTcTGCA￡范ACCCTCGGG直AAAzG1陌口G{：1AAAAC贸AG舀矗矗CTTATGGCTGGA＆舀盎AC忑A舀矗GACC℃CGTTGGATTACTTCCGrrC田CACCTTTTA了CAZT工T再矗ATTCTCCTC；I?ZTCGAAGCCACAGCTGGTr_rGGGGGG矗GTAGTTTAAG磊鱼芝AAC鱼GAAZTCAACcTCCCCCTCCTGGGcGTTT_TGAAA6厦TGCCATC(捂CGGAGGAcTTGGATACG图4-4JXPCV2全基因序列Fig．4-4thecompletegenomesequenceofJXPCV2用Chroms，DNAstar等软件对测序结果进行读取和分析。12345678910111213141狙_i95．699．599．296．598．793．999．595．998．998．598．977．277．4124．5_i95．895．496．196395．095．997．496．495．996．476．976．8230．54．3蛋■■i99，598．698．894．299．996．098．998．499．077．777．8340．94．70．5_；98．198．393．799．595．598．597．098．577．577．6451．54．0'41．9199．893．998．695．799．398．899．576．977．156133．81．21．70．2i●94．198．895．999．599．099777．177．2676．45．26066646．2l■q4．295．494．293．694．276．576．6780．54．30．10．51．41．361ll{96．098．998．499．077．677．88g4．2264．14．64．44．24．8411—雕96．095．596077．19101．13．71．11．50．70．56．11．14．1-l99．299．777．371．410111．54．31．72．11．21．06．71．74．70．gl_5口9．277．077．111121．13．71．01．50．50．36．01．D410．30．9—匪77．377．4121327．227．626．526．827．627．328．326．627．327．127．527．1l■●99．3131427．027．726．326．727．427．228226．427．426．927．426．go．7l■14123456789101112t314图4-5PCV2分离株全基因组序列比较。ATGC嚣A祛CTG盈AzAAZCGATZATZTTA13￡s双10匹1TG|CCA(：矗ZcGGGCAACTTACACTGCT镀GAGTAACG誓ZT6CA＆2执GCGTGAGCA舀舀TGGGAA锻GG誓GGG口岱0C．c芏GGGGGTGGAACrGGA醵G醒ACrTTGGTA暑zTTCTTTCCeCCCTCGTAAzGGZTGAATTGT矗CACGnCjk6王GCeGA工TTCrTTTTA矗磊GTAGCGCATAGGGGTCCACrGGAGCCTAACC芏TTCZGGGGAAGAA鱼CTG茁GGZTCGTTTTCCTT∞1rC：TGGCC矗AG．rCATAZCT强EF421973．1Huanan-8NC005148．1AUTl^Y424405AUT5A丫732494JAil；JiangxiDQl80393putian0401^Y556475GXAF364094taiwan^Y322000franceA、，325495saAY691169zhejiangJ×PCV2PCV-2JXDQ650650NC006266Fig．4-5ComparisionofthecompletegenomesequencesofPCV2isolate．43 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染结果表明，本实验分离株(JXPCV2)与国内外不同地域的PCV2全基因组序列的差异很小，同源性在94．2％---99．7％之问。807．3]—1—rT—T1—广叩5002001005020105210NucleotideSubstitutions(xloo)图4-6PCV2系统进化树Fig．4—6PhylogenetictreeanalysisofPCV2应用DNAStar中MegAlign分子生物学软件绘制PCV2全基因进化树，从PCV2全基因进化树中可以看出，本试验分离株(JXPCV2)同浙江分离株存在较近的亲缘关系。3讨论本试验应用PCR法检测不同地区猪场表现PMWS症状猪只组织、脏器中的PCV2，设计合成PCR扩增引物，该引物可以特异地检测出PCV2病毒。本试验在对l株自江西某猪场分离的PCV2毒株(暂命名为JXPCV2)将扩增产物经回收后克隆到pUCm—Tvector中，序列分析与GenBank上发表的全基因序列相比较，具有良好的同源性(94．2*／'o---99．7％)。因此将该引物可应用于实验室的PCV2诊断；该毒株的分离及鉴定为进一步开展其生物学特性及其免疫源性的研究工作奠定了基础。用DNAStar软件对该序列和Genbank上近年来国内外发布的一些PCV2毒株全序列(包括中国台北毒株AF364094，法国毒株AY322000，南非毒株AY325495，浙江毒株AY691169，奥地利毒株NC005148、AY424405，福建DQl80393，中国华南毒株EF421973，广西毒株AY556475，江西毒株AY732494；国内发表的PCVl全序列(登录号DQ650650和NC006266))进行对比分析发现，分离毒株JXPCV2株和国内外分离的PCV2毒株的同源性在94．2％至99．7％之问；而与国内发表的PCV一1全序列的同源性约为77％。JXPCV2株与浙江毒株(AY691169)和广西毒株(AY556475)枷舢蝴睫5一拍M州删似舢觚M州：董∞刚}罟，～～～一一～一一一一一一一一 试验研究第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析同源性最高，为99．7％，与中国台北毒株(AF364094)同源性最低，为94．2％(图4．6)，而与PCV2JX株的同源性为99．2％，与江西毒株的同源性为98．5％。WangC等【9】对台湾2000年到2002年分离到的PCV2进行测序分析，发现它们的同源性达到了95％'--"99％。与国外分离株全基因组比较发现，同源性达到92％～99％0I心2推导的氨基酸与国外分离株同源性达到91％--一99％。系统进化树可以看出PCV主要有两个较大的分支，一个为PCVl构成的分支，另一个分支由PCV2构成。在PCV2构成的分支中，主要由两大亚支构成，来自奥地利(NC005148)、中国台北和南非的毒株构成一个亚支，他们的基因组长度为1768bp；而来自其他国内外的分离毒株构成另一个亚支，由PCV2中国浙江毒株(DQl95679)、本试验分离毒株JXPCV2、本实验室分离毒株PCV2JX、福建莆田DQl80393和广西毒株AY556475构成1767bp。在PCV2分支中，JXPCV分离株与中国浙江毒株(DQl95679)的亲缘关系较近，且与本实验室分离毒株PCV2JX共同构成一个亚支；与福建莆田和广西毒株一起构成一个较大亚支；江西毒株(AY732494)、中国华南毒株和奥地利毒株(AY424405)构成一个亚支，与前两个亚支构成一个全长为1767bp的分支。而FenauxM等【loj研究表明，遗传进化树的小分支与地域有关，且它们在各自的地域缓慢发生进化研究表明，通过氨基酸比较，发现在临床症状不同的PCV2感染中，其ORF2有微小差异，推测ORF2的微小变化可能是临床床症状变化的主要原因，但LarochelleR等【ll】通过对不同症状的PCV分离株的遗传树构建，表明不同小分支的感染后的临床症状没有明显的相关性。PCV2基因组序列相对稳定，但分离自不同地区的毒株会有一定的差异。本实验从江西省疑似PMWS的病猪中检测到PCV2，并通过建立全基因PCR检测方法，扩增出所需的片段，进行片段回收、克隆、全基因测序，结果表明该建立的PCR方法是可行的，及与其他PCV2毒株序列的分析比较，对本省PCV2的来源及与其他地区毒株的关系作了有意义的探讨。猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前已知脊椎动物病毒中最小的病毒。学术界一直认为PCV2是圆环病毒病的主要病原，进一步根据基因进化数据PCV．2又可以分为PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d，PCV2e等几个亚基因型，其中PCV2a和PCV2b是主要类型，PCV2c仅在丹麦发现。PCV2b在当前自然感染中流行，被认为有较强的致病性。PMWS阳性场可能与PCV2b相关。遗传学发现PCV2a早于PCV2b出现。澳大利亚仅存在有PCV2a，却没有PMWS病例出现，由此分析PMWS的暴发与该病毒从PCV2a到PCV2b的改变有关。但不同国家或地区的分离毒株全基因序列进化树分析表明，该病毒已出现了与区域相关的多个基因分支，其中，南非的1个分离毒株、台湾的1个分离毒株及奥地利的1个分离毒株形成了1个独立45 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染分支。本试验的JXPCV2核苷酸序列与国内毒株同源性较高，这可能与国内猪群的引种和生猪的转运有关。 试验研究第四章猪圆环病毒2型江西分离株的全基因序列分析参考文献【l】AllanGM，MeehanB，ToddD．Novelporcinecircovirusfrompigswithwastingdiseasesyndromes[J]．VetRec．1998，142：467-468【2】2J．Kim，H．K．Chung，C．Chae．Associationofporcineciecovirus2withporcinerespiratorydiseasecomplex[J]．theveterinaryjournal，2003，166：251-256【3】高骏，胡建华，孙风萍，等．猪圆环病毒研究进展【J】．上海交通大学学报(农业科学版)．2005，23(1)：107-110【4】郎洪武，王力，张广川，等．猪圆环病毒分离鉴定及断奶仔猪多系统衰弱综合症的诊断[J]．中国兽医科技，2001，31(3)：3-4【5】李春华，魏晓锋．与II型猪圆环病毒相关的综合征和疾病【J】．国外畜牧学．猪与禽．2005，25(6)：42-48【6】吴家强，任素芳，胡北侠，等．猪断奶后多系统衰竭综合征诊断方法研究进展阴．山东畜牧兽医．2004，5：44-45[7】吕艳丽，杨汉春，郭鑫．用PCR检测猪圆环病毒II型[J】．中国兽医学报．2002，22(6)：552．554[8】戴益民，何后军，李红．猪圆环病毒2型江西毒株的全基因扩增与序列分析[J]．中国兽医杂志．2005，41(8)：10-12【9】WangC．HuangTS，HuangCC，eta1．Characterizationofporcinecireovirustype2inTaiwan．【J]JVetMedSci，2004，66(5)：469～475[10】FenauxM，HaiburPG，GillM，eta1．neticcharacterizationofty。pe2Porcinecircovirus(PCV-2)frompigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeindifferentgeographicregionsofnorthAmericaanddevelopmentofdifferentialPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaytodetectanddifferentiatebetweeninfectionswithPCV-IandPCV-2[J]．ClinMicrobiol，2000，38(7)：2494～2503[11】LarochelleR，MagarR，DallaireS．GeneticcharacterizationandphylogeneticanalysisofPominecircovirustype2(PCV-2)strainsfromcasespresentingvariousclinicalconditions[J]．VirusRes，2002，1290(1)：101～11247 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染CompleteGenomeSequenceAnalysisofPCV2(∞xPcv2)IsolatedFromJiangxiABSTRACT：AccordingtothepublishedcompletegenomesequencesofPCV2，apairofprimerswasdesignedtoamplifytheentiregenomesequenceofJXPCV2isolatedfromapigfarminJiangxi．ThePCRproductwaspurifiedusingcommercialkit．Afterwards，thepurifiedampliconWasclonedintopUCm．TvectorandthentransfectedintoEcoli．DH5a．TherecombinationplasmidwasidentifiedbydigestionofdifferentrestrictionenzymesandPCR，andthensequenced．TheresultsofsequencinganalysesshowedthatJXPCV2sharedhigherhomologywiththestrainsisolatedfromChinaandothercountries，whichWasrangedfrom94．2％一99．7％．PhylogenetictreeanalysisrevealedthatJXPCV2wasclustered晰tlltenisolates，andmostcolselyrelatedtoZhengjiangisolate(accession捍AY691169)．KEYWORDS：PCV-2；Completegenome；Sequenceanalysis48 试验研究第五章江西部分市县猪群猪戊型肝炎血清流行病学调查第五章江西部分市县猪群猪戊型肝炎血清流行病学调查摘要：为了解江西猪群猪戊型肝炎病毒感染的血清学情况，以7株(缅O；株p166Bur、墨西哥株p166Mex、美国株p166Us、中国株p166Chi、摩洛哥株p166Mor、巴基斯坦株p166Pak、新西Z捌kpl66Nz)不同基因型的HEVORF2(编码中和抗原表位452～617aa)基因工程表达重组蛋白的等量混合物(p166Mix)作为包被抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG-：未g作为酶标抗体，确定反应最佳条件，建立间接ELISA方法。用此方法对430份来自江西猪群的血清样品进行戊型肝炎病毒IgG抗体检测，其中商品猪(>6月龄)样Yt,380份，349份呈阳性，阳性率为91．8％；3～5月龄猪样Yc,20份，13份呈阳性，阳性率为65．0％；小于3月龄猪样品30份，10份呈阳性，阳性率为33．3％。统计分析表明不同月龄猪HEV抗体阳性率差异极显著(P<0．01)，且阳性率与猪的月龄成正相关性，不同区域的商品猪HEV抗体阳性率差异不显著(P>0．05)。关键词：猪戊型肝炎；血清；流行病学；调查戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)是一种经肠道传播的非甲．非乙型肝炎病毒，该病毒感染人类，导致人戊型肝炎的发生，发病重病死率高，轻壮年病死率1—2％，孕妇高达20％，严重危害人类的健康。HE是一种人畜共患病，猪是一种HEV最常见的中间宿主111，其感染HEV常呈隐性过程，基本无症状，但在其感染过程中可排出HEV，污染环境导致人HEV的发生，最常见的感染途径是粪口感染。有最新证据表明【2】，饮食未经高温的猪肝，也可导致人HE的感染。因此，对猪感染HEV状况进行调查，预防猪感染HEV，切断HEV的传播途径，对防止HEV在人群中的流行具有指导意义。评估HE流行病学的重要指标之一是HEV抗体的检测，最初HEV血清学的检测是免疫电镜技术和荧光抗体阻断技术，两种方法利用的都是天然抗原，虽然这些方法特异性好，但是敏感性低，在HE爆发流行时也只能检测到50％～70％的HE患者，并且在急性感染后几个月就无法再检测到抗体。随着HEV的克隆与测序，出现了一系列的血清学检测技术，包括Western转印(WB)和酶免疫测定技术(E认)，这些技术都是利用ORF2和ORF3抗原表位的基因工程表达蛋白和合成肽作为抗原，和以天然病毒作为抗原相比，敏感性提高到90％～95％【3】。目fi．ifHE的血清学诊断主要是用间接ELISA，49 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染动物中进行HEV血清流行病学调查亦多采用间接ELISA。目前，我国很多地区都有报道HEV在猪群中的流行，但江西省猪群感染HEV状况如何还不得而知。为了摸清HEV在猪群中的感染情况，就必须建立一个敏感、特异的诊断方法。其中抗原的选择是决定反应特异、敏感的关键。已有报道不同基因型间核苷酸序列的差异会影响表达蛋白的抗原性，因此本次试验用多基因型HEV重组蛋白建立检测猪HEV抗体IgG的间接ELISA，同时进行了各种反应条件的优化，提高了实验的灵敏性和特异性，并对来自江西不同市县，不同月龄的猪做以HEV感染情况的血清学调查。1材料与方法1．1材料1．1．1包被抗原根据HEV缅甸(Bur)株、墨西哥(Mex)株、美国(Us)株、中国(Chi)株、摩洛哥(Mor)株、巴基斯坦(Pak)株、新西兰猪(Nz)株结构区基因序列，采用RT．nPCR技术扩增编码HEVORF2452---617位氨基酸的基因片段，再将此片段连接于pGEX一4T．2质粒表达GST．HEV融合蛋白，经GST—Sepharose4B亲和层析纯化得到7种重组蛋白(简称为p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chi、p166Mor、p166Pak、p166Nz)，将7种重组蛋白等量混合后(混合抗原简称p166Mix)作为包被抗原。由东南大学基础医学院孟继鸿教授惠赠。1．1．2血清样本380份商品猪(6月龄以上)血清采自南昌某生猪定点屠宰厂，分别来自六个区域，50份猪(小于5月龄)血清采自某种猪场，HEV阳性血清由东南大学孟继鸿教授惠赠，阴性血清(SPF猪血清)购自北京赛泰克生物科技有限公司，猪口蹄疫参考阳性血清(O型)、猪瘟参考阳性血清由兰州兽研所惠赠，猪繁殖与呼吸综合征参考阳性血清、猪伪狂犬参考阳性血清由哈尔滨兽研所惠赠，猪细小病毒参考阳性血清、猪衣原体参考阳性血清购自湖北畜牧兽医研究所，血清样本一20。C冷冻保存。1．1．3主要试剂HRP标记羊抗猪IgG：KPL公司产品BSA脱脂乳白明胶犊牛血清50 试验研究第五章江西部分市县荨i}}群猪戊型肝炎血清流行病学调查’l。MBTween．20其余所有化学试剂均为国产分析纯1．1．4主要溶液及其配制1．1．4．1抗原包被缓冲液(0．05MpH9．6碳酸盐缓冲液)NaC031．609NaI-IC032．909加950mLddH20溶解，调pH至9．6，定容至1L，现用现配。1．1．4．2磷酸盐缓冲液(0．01MpH7．2PBS)NaCL8．009KCL0．209Na2HP04．12H202．899KH2P040．209加950mLddH20溶解，调pH至7．2，定容至1L。1．1．4．3洗涤液【0．01MpH7．2PBST)量取0．01MpH7．2PBS1000mL，加入0．5mLTween-20，混匀。1．1．4．4封闭液称取19脱脂乳，用适量PBST溶解，定容至100mL。1．1．4．5血清及酶标二抗稀释液量取洗涤液100mL，加入100mg白明胶加热溶解，冷却后加入lg脱脂乳，混匀。1．1．4．6底物溶液(1)底物液A(TMB)-TMB200mg，DMS0100mL，加ddH20至1000mL。(2)底物液B：Na2HP0414．69，柠檬酸9．339，过氧化氢1．5mL，加ddH20至1000mL，调pH至5．0。(3)将底物液A和底物液B按l：l混合即成底物应用液。1．1．4．7终止液(2M硫酸)量取浓硫酸4mL缓慢加入32mL去离子水中，混匀。1．2方法1．2．1血清样本的制备采集到的猪新鲜血液，收集到10×100容积的灭菌试管中，4"C放置8h，后在高速落地式离心机上5000r／min离心5min，然后把上清液转移到一个灭菌的离心管里，一2051 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染保存备用。1．2．2p166Mix抗原最适包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定用包被液把p166Mix依次做50、100、200、400、800、1000、2000、4000倍稀释，100p．1／孔包被酶标板，4．0过夜。次日，将包被好的酶标板倒去孔内液体，洗涤三次后，加入封闭液100M1／孑L，37℃作用1h后洗涤五次。HEV阳性血清和SPF猪血清分别用血清稀释液稀释12．5、25、50、100、200、400倍，100“l／孔，与包被抗原不同稀释度组成方阵，震荡混匀，37℃湿盒温育1h，洗涤五次后加入2000倍稀释的酶标抗体HRP．羊抗猪IgGloo“l／孔，震荡混匀，37"C湿盒温育30min，洗涤五次后加入底物应用液100pF孔，于37"0避光显色10min。终止反应后在酶标仪上读出OD450，比较阴阳性血清的OD值，选择阳性OD450值为l左右和阴性OD450值较低的抗原包被浓度和阴阳性血清的稀释度，从而确定抗原的最适包被浓度及血清的最佳稀释度。1．2．3封闭液的选择及封闭时问的确定用包被液将p166Mix进行适当稀释(1：1000)并包被酶标板，4"0过夜，分别用1％脱脂乳，10％犊牛血清，1％白明胶，I％BSA包被，设37℃0．5h、lh、2h三个组，每一组中的每一种封闭液阴阳性血清各设4个重复。然后按照ELISA程序依次加入阴阳性血清，酶标二抗，和底物。37．0避光显色lOmin，终止反应后测其OD450值，选取阴性OD值最小，P／N比值最大的封闭组合，以确定封闭液及封闭时间。1．2．4血清稀释液的选择将p166Mix进行适当稀释(1：1000)，100lxl／孑L包被酶标板，4"0过夜，1％脱脂乳37．0封闭1h，用1％脱脂乳、1％白明胶、I％BSA、10％犊牛血清四种血清稀释液稀释同一份阴阳性血清各100倍，loo．I／：j：L，每一种血清稀释液阴阳性血清各设4个重复，37℃作用lh，洗涤后依照既定程序加入酶标二抗和底物。选择阳性OD值较高，阴性OD值较低，P／N值最大的一组作为血清稀释液。1．2．5阴阳性血清与包被抗原反应时间的确定用包被液将p166Mix进行适当稀释(1：1000)并包被酶标板，4"C过夜，加入封闭液100斗l／孔37℃封闭1h，用血清稀释液稀释阴阳性血清各100倍，100pY孔，设三个组，每一组阴阳性血清各设8个重复，分别于37℃作用O．5h、lh、1．5h，充分洗涤后按照ELISA程序依次加入适当稀释的酶标二抗和底物。37℃避光显色10min，终止反应后测其OD450值，选取阴性OD450值最小，P／N比值最大反应时间。1．2．6酶标二抗的作用时问的确定用抗原包被好的酶标板，按照ELISA程序封闭、加入阴阳性血清、洗涤五次后再和酶标二抗反应，设30min、60min、90min三个作用时间实验组，每一组阴阳性血清各设8个重复。之后加入底物，37℃避光显色10rain，终止反应后测其OD450值，选52 试验研究第五章江西部分市县猪群猪戊型肝炎血清流行病学调查取阳性OD值在1．0附近，P／N比值最大，阴性OD值较小的一组作为最佳的二抗作用时间。1．2．7问接ELISA方法阴阳性临界值的确定用p166Mix包被好的酶标板，按照已建立的间接ELISA方法，检测28份SPF猪血清。计算其OD450的平均值(A)及标准方差(s)。阴阳性临界值(CO)=阴性血清OD450的平均值(A)+5x标准方差(s)。1．2．8特异性反应试验为了检测建立ELISA的特异性，用猪常见多发病的参考阳性血清(包括猪口蹄FMDV疫参考阳性血清(O型)、猪瘟(CSFV)参考阳性血清，猪繁殖与呼吸综合征(PI讯SV)参考阳性血清、猪伪狂犬(PIW)参考阳性血清，猪细小病毒(PPV)参考阳性血清、猪衣原体(MHP)参考阳性血清，与包被抗原p166Mix进行ELISA反应，测定各血清的OD值。1．2．9问接ELISA的操作步骤1．2．9．1包被用包被缓冲液稀释p166Mix(1：lOOO)，每孔加入1009l，4。C过夜。1．2．9．2洗板甩掉板孔内的液体，向每孔注入3001．d洗液，浸泡3min，甩干，再重新注入洗液，重复洗三次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。1．2．9．3封闭每孔加入1009l封闭液，37"C温育lh。1．2．9．4洗板甩掉板孔内的封闭液，按(2)方法洗五次。1．2．9．5加样每孔加入稀释100倍的样品100ltl，37℃温育lh。1．2．9．6洗板甩掉板孔内的液体，按(2)方法洗五次。1．2．9．7加酶标记抗体每孔加入100／．tl经过稀释的酶标二抗(1：2000)，37"C温育30min。1．2．9．8洗板甩掉板孔内的酶标记抗体，按(2)方法洗五次。1．2．9．9加底物溶液把底物液提前从4"C冰箱中取出，在室温下放置20～30min，待温度平衡后，将两种底物液按1：l混匀，每孔加入1001．d，于37"C避光显色10min。1．2．9．10终止反应每孔加入509l终止液终止反应。1．2．9．11测定结果用酶标仪于450nlil处测定各孔OD值。1．2．10应用本实验建立的间接ELISA测定血清样本01)值应用以上确定的各项条件进行ELISA实验，对来自南昌周边六区域不同品种的商品猪p6月龄)3so份血清样品及采自某种猪场50份猪血清(3---5月龄20份，<3月龄30份)进行抗体IgG的检测，具体方法参照1．2．9，每板设空白、阳性血清、阴性血清对照各两孔，每个样本设两个重复，并对实验结果进行统计学分析处理。 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染2结果与分析2．1p166Mix抗原最适包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定将纯化的重组蛋白p166Mix依次做50、100、200、400、800、1000、2000、4000倍稀释，100l_d／孔包被酶标板，4℃过夜。用血清稀释液将HEV阳性血清及阴性血清分别作12．5、25、50、100、200、400倍稀释，1001．tl／孑[,，与包被抗原不同稀释度组成方阵，作ELISA测定，结果见表5—1。由表5—1结果可知，当抗原的包被浓度做1：1000倍稀释，阴阳性血清1：100稀释时，阳性血清的OD450值在1．O左右，且阴性血清OD450值较低。据此，确定抗原的包被浓度为1：1000，阴阳性血清的最佳稀释度为l：100。表5-1最适抗原包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定一Table5-1Thedeterminationforthecoatingconcentrationoftheantigenandoptimal!曼翌翌堡卫坐!竺里血清的稀释倍数200400+．+．+．+．+．+一注：+表示HEV阳性m清，一表示阴性m清；行是抗原稀释倍数，列是阴阳性m滴稀释倍数。2．2封闭液的选择及封闭时间的确定用包被液将p166Mix进行适当稀释(1：1000)并包被酶标板，4"C过夜，分别用1％脱脂乳，10％犊牛血清，1％白明胶，I％BSA包被，设37。C0．5h、lh、2h三个组，54 试验研究第五章江西部分市县猪群猪戊型肝炎血清流行病学调查每一组中的每一种封闭液阴阳性血清各设4个重复。然后按照ELISA程序进行测定，结果见表5。2、5—3、5．4。表5-2封闭液的选择及封闭时间的确定(一)Table5—2Theselectionofblockingsolutionandthedeterminationofblockingtime(1)表5．3封闭液的选择及封闭时间的确定(二)Table5．3Theselectionofblockingsolutionandthedeterminationofblockingtime(2)表5_4封闭液的选择及封闭时间的确定(--)Table5-4Theselectionofblockingsolutionandthedeterminationofblockingtime(3)注：+表示CAV阳性m清，．表示CAV阴性m清。55 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染由表5．4可看出，由于封闭时间过短，阴阳性OD值均较高，故封闭0．5h不妥；同样地，封闭时间为2h的组，虽然阳性血清OD值接近1．0，阴性血清值也较低，但P／N值偏小，只有封闭1h组阳性血清接近1．0，阴性血清也较低，同时P／N值也是3组中最大的，而用1％脱脂乳封闭组P／N值最高，因此确定用1％脱脂乳作为封闭液，封闭时间确定为1h。2．3血清稀释液的选择将p166Mix进行适当稀释(1：1000)，lOO；tl／孑L包被酶标板，4"C过夜，1％脱脂乳37"C封闭1h，用l％脱脂乳、1％白明胶、I％BSA、10％健康犊牛血清四种血清稀释液稀释同一份阴阳性血清各100倍，100rd／孑L，每一种血清稀释液阴阳性血清各设4个重复，37℃作用1h，洗涤后依照既定程序进行检测，结果见表5．5。表5．5血清稀释液的选择Table5—5Theselectionofserumdiluent注：+表示HEV阳性j『IL清，．表示阴性m清。从表5—5可以看出，用1％脱脂乳做血清稀释液时P／N值最大，故选取l％脱脂乳做血清稀释液。2．4阴阳性血清与包被抗原反应时间的确定用1：1000浓度的抗原包被酶标板，4"C过夜，加入封闭液100rd／孑L37"C封闭lh，用血清稀释液稀释阴阳性血清各100倍，100肛1／孔，设三个组，每一组阴阳性血清各设8个重复，分别于37℃作用O．5h、1h、1．5h，充分洗涤后按照ELISA程序进行测定，结果见表5-6。 试验研究第五章江西部分市县猪群猪戊型肝炎血清流行病学调查表5-6阴阳性血清与包被抗原反应时间的确定Table5-6Thedeterminationforreactivetimeofseraandantigencoated注：+表示HEV阳性JflL清，。表示阴性粗清。从表5．6可以看出，阴阳性血清与包被抗原反应时间为1h的组，阳性OD值较大，阴性OD值较低，P／N值最大，故将阴阳性血清与包被抗原的最佳反应时间定为lh。2．5确定酶标二抗的作用时间用包被好的酶标板，按照ELISA程序依次封闭、加入阴阳性血清、洗涤五次后再和酶标二抗反应，设0．5h、lh、1．5h三个作用时间实验组，每一组阴阳性血清各设8个重复。加底物显色后，测定它们的OD值，结果见表5—7。表5．7酶标二抗的作用时间的确定Table5—-7ThedeterminationforreactivetimeofPeroxidase·-conjugatedRabbitAnti-Chicken注：+表示HEV阳性m清，一表示阴性J6L清。从上表可以看出，血清样本与酶标二抗作用O．5h时，P／N值稍大于作用lh和1．5h57 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染组，故选择O．5h为酶标二抗作用时问。2．6间接ELISA方法阴阳性临界值的确定用p166Mix包被好的酶标板，按照已建立的问接ELISA方法，检测30份SPF猪血清，计算其OD450的平均值及标准方差，结果如表5．8、5-9。表5-8ELISA方法阴阳性临界值的确定(1)Table5．8ThedeterminationofthethresholdforELISA(1)表5-9ELISA方法阴阳性临界值的确定(2)Table5．9ThedeterminationofthethresholdforELISA(2)根据表5．8和表5-9算出30份SPF猪血清样本的0D450平均值为0．085，标准方差为O．011。因此，阴阳性临界值CO=0．085+5×0．011=0．140。即在阴阳性对照成立的情况下，OD450大于0．140就可以判定为HEV抗体阳性；否则，判为阴性。2．7特异性反应试验根据自己建立的ELISA方法，检测各种猪常见多发病病原阳性血清(FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PPV、MHP)，结果如表5—10。表5．10特异性反应试验——．!垒垒!堕：!Q!堕璺P曼里!!!!：望竺!l塑堡坠旦!堡12巴!i翌磐!P翌堡i翌FMDVCSFVPRRSVPRVPPVMHP结果表明，以上各种病原阳性标准血清的OD450均小于0．140，为阴性。说明抗原p166Mix与这些血清没有交叉反应，特异性良好。 试验研究第五章江西部分市县猪群猪戊型肝炎衄清流行病学调查2．8应用本实验建立的间接ELISA测定血清样本HEVIgG结果按照上述间接ELISA的各项条件，进行ELISA实验，对来自南昌周边六地区不同品种的商品猪(>6月龄)380份血清样品及采自农大种猪场50份猪血清(3～5月龄20份，<3月龄30份)进行抗体IgG的检测，具体结果如下：表5一11不同地区猪HEVIgG的比较Table5—11ComparisonofHEVIgGinswineatdifferentregions地区血清样本数阳性样本数HEVIgG阡{性率表5-12不同月龄猪HEVIgG的比较Table5．12ComparisonofHEVIgGindifferentswineage月龄血清样本数阳性样本数HEVIgG阳性率差异显著性分析：采用SAS软件对以上数据进行卡方分析，结果表明HEV抗体阳性率与地理位置差异不显著(P>O．05)，与猪的月龄差异极显著(P6month·oldpigs，20from3-5month—oldpigs，and30from<3month—oldpigs，respectively．TheresultsofELISArevefledthat349outof380(91．8％)，13outof20(65．0％)and10outof30(33．3％)weresero—positiveforHEV．ItsuggestedthatswineHEVinfectionswereseriousindifferentpigfarmsinJiangxi，andthepositiverateofanti—HEVantibodywaspositivecorrelation、析ththeageofswine．Statisticalanalysisdemonstratedthatthesero—positiveratewasnotrelatedtogeographicregions(p>0．05)，buttherewasasignificantdifferenceamongages(P<0．01)．KEYWORDS：SwinehepatitisEvirus；Serum；Epidemiology；Survey62 试验研究第六章江西部分市县猪群猪戊型肝炎病毒RNA的检测第六章江西部分市县猪群猪戊型肝炎病毒RNA的检测摘要：为了解江西猪群猪戊型肝炎病毒的感染情况，采集江西4个市县7个集约化猪场不同月龄猪粪样品271份，其中A猪场40份、B猪场40份、C猪场30份、D猪场43份、E猪场18份、F猪场49份和G猪场51份。利用逆转录套式PCR方法(RT-nPCR)，检测HEVRNA，结果表明A猪场阳性7份，阳性率17．5％；B猪场阳性10份，阳性率25．0％；C猪场阳性7份，阳性率23．33％；D猪场阳性11份，阳性率25．58％；E猪场阳性4份，阳性率22．22％；F猪场阳性7份，阳性率14．29％；G猪场阳性4份，阳性率7．84％；总阳性50份，总阳性率为18．45％。在271份样品中，0一1月龄31份，阳性3份，阳性率9．68％；l一2月龄24份，阳性7份，阳性率29．17％；2～3月龄116份，阳性27份，阳性率23．28％；3～4月龄17份，阳性3份，阳性率17．65％：4～5月龄25份，阳性3份，阳性率12．oo％；5—6月龄26份，阳性4份，阳性率15．38％；大于6月龄32份，阳性3份，阳性率9．38％。关键词：猪戊型肝炎病毒；RT-nPCR；检测戊型肝炎病毒(HEV)是一种严重危害人类健康的肝炎病毒，在世界范围内存在，其核酸类型为单股正链RNA，大小约7．2kb，包括5’非翻译区(uTR)，三个开放读码框架(ORFsl．3)和有PolyA尾的3’非翻译区。ORFl位于第28—5107nt之间，主要编码与HEY复制有关的非结构蛋白；ORF2位于5147．7127nt之间，为HEV主要结构蛋白编码区，编码病毒衣壳蛋白；ORF3由369nt组成，3’端与ORFl有Int重叠，3’与ORF2有328nt重叠，编码产物与HEV的特异性免疫反应有关ul。根据现有分离株的核苷酸序列分析，分成4个主要的基因型【2】。基因I型主要来自亚洲和非洲，基因II型以墨西哥株为代表，基因III型以美国株为代表，基因Ⅳ型来自中国大陆、中国台湾和日本。自从Meng等发现猪源HEV与美国本土急性戊型肝炎患者分离的HEV核苷酸的同源性在92％以上，属基因ⅡI型pJ，此后各国纷纷对HEV的动物宿主进行研究，最近更有Et本学者报道人由于食用生鹿肉及猪肝而患HE，追踪性调查发现在剩余鹿肉检出与患者相同的HEVt引，其ORFl部分核苷酸序列同源性达99．70／旷100％14J。为了解江西猪群感染HEV的情况，。对来自江西4个市县7个集约化猪场不同月龄猪粪样本271份进行了HEVRNA的监测。63 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染1材料与方法i．1材料1．1．1粪便来源采集江西4个市县7个集约化猪场不同月龄猪粪样本271份，A猪场40份、B猪场40份、C猪场30份、D猪场43份、E猪场18份、F猪场49份和G猪场51份。冷冻运输，一20℃保存备用。1．1．2酶和其他试剂YRIzol为BBI产品，RNAPCRKit(AMV)Ver．3．0购自大连宝生物公司，PCR扩增试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DEPC、糖原购自上海生工，氯仿、异丙醇等其他试剂均为分析纯试剂，DNAMarkerDL2,000购自大连宝生物公司。1．1．3简并引物设计及合成根据GenBank的HEV序列从ORF2设计一套简并引物，预计目的片段预计的348nt，由上海生工合成。外引物：A1：5'-AAT(C)TATGCC(A)CAGTACCGGGTTGA2：5’。CCCTTATCCTGCTGAGCATTCTC内引物：A3：5'-GTT(C)ATGC(T)TT(C)TGCATACATGGCTA4：5'-AGCCGACGAAATC(T)AATTCTGTC根据GenBank的HEV序列从ORF2设计另一套简并引物，预计目的片段预计的236nt，由上海生工合成。外引物：B1：5‘．CCGACAGAp汀TGATTTCGTCGGC一3cB2：5'-CCG"r从GTCGACTGGTCGTACTC一3‘内引物：B3：5‘一GTTGTCTCGGCCAATGGCGAGCC一3cB4：5'-TCGGCGGCGGTGAGAGAGAGCCA．3‘1．1．4主要溶液的配制1．1．4．1磷酸盐缓冲液(0．01MpH7．4PBS)NaCL8．OOgKCL0．209Na2HP04．12H202．899KH2P040．209加950mLddH20溶解，调pH至7．4，定容至1L。1．1．4．20．1％DEPC 试验研究第六章江西部分市县猪群猪戊型肝炎病毒RNA的检测DEPC原液0．1mLddH20100mL将0．1mLDEPC原液加入100mLddH20中，轻轻混匀，再对容器进行密封，防止DEPC挥发。1．1．4．350xTAE(Tris．乙酸)电泳缓冲液(pH8．5)"Iris碱2429冰乙酸57．1mLNa2EDTA．2I-／2037．29加水至1000mE，混匀。1．2方法1．2．1粪样品的处理用PBS(0．01M，pH7．4)将猪粪便制备成10％的悬液，充分混匀，然后6000r／min于4。0离心45min，收集粪便上清保存于．20℃。1．2．2HEV基因组RNA的提取所有接触RNA的试剂、滴头、器皿等(包括配试剂用的H20)均经0．I％DEPC水处理并灭菌。用TriZ01分离液(BBI公司产品)提取总RNA，步骤如下：取1009L粪便上清加lmLTRIzol，加入糖原(终浓度为250rtg／mL)，用枪头反复抽吸混匀。用lmL针筒，26一G号(6群)针头抽吸混合液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1．5mL离心管中。加入0．2mL氯仿，剧烈振荡30s。室温静置2～15min。在4"0条件下台式离心机上12，000r／min离心15min。将无色的上层水相转移至另一RNase．free1．5mL离心管中，加入等体积异丙醇，涡旋混匀，室温静置5～10min。在4*0条件下12，000r／min离心10min，小心弃掉上清，防止RNA沉淀丢失。加入70％的乙醇洗涤两次，每次700rtL，12，000r／min4。C离心2min。尽可能的彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。在室温下空气干燥20min使酒精完全挥发。沉淀用109LDEPC水溶解，在37℃水浴中处理10min。 猪圆环病毒2型与猜戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染RNA样品立即进行RT-PCR或保存于．80℃。1．2．3ImnPCR1．2．3．1RT(1)按下列组成配制RT反应液MgCl2lOxIU’Bu旋rRNasefreedH20lOmmoI／】[』dNTPSRNaseInhibitorK涵N忌飞P2(40pmol／BL)RNA模板2pL1此3．75p．LllxL0．25此O．5pLO．51aL1“LTotal10此(2)反应条件：42。C30min，99。C5min，5。C5min。反应在基因扩增仪(PTC一1000型，MJResearchInc)上进行。1．2．3．2套式PCR第一轮反应(1)按下列组成配制PCR反应液5xPCRBufferddH20TaKaRaExTaqHSP1(20pmol／ItL)10}tL29．251xL0．25此0．5pLT0tal40pL将上述反应液加入到RT反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。(2)反应条件：94。C预变性2min；然后94。C30s、55。C30s、72。Clmin扩增30个循环；最后一个循环结束后72。C延伸10min。反应在基因扩增仪(PTC．1000型，MJResearchIne)上进行。1．2．3．3套式PCR第二轮反应(1)按下列组成配制PCR反应液10xPCRBuffer25mmol／LMgCl2l0mmo儿dNTPsP3(20pmoⅣuL)P4(20pmol／i．tL)TaqDNA聚合酶(5U／pL)第一轮PCR产物2．5pL2肛LllaL0．5斗L0．5pL0．251aLlpL加ddH20至25I．tL(2)反应条件：94"C预变性2min：然后94。C30s、55。C30s、72"Clmin扩增30 试验研究第六章江西部分市县猪群猪戊型肝炎病毒RNA的检测个循环；最后一个循环结束后72。C延伸10min。反应在基因扩增仪(PTC一1000型，MJResearchInc)上进行。1．2．4PCR产物鉴定配制1％琼脂糖凝胶，加入终浓度为0．5ug／mL的溴化乙锭(EB)。取51xLPCR产物与上样缓冲液混合后加入加样孔，以1xTAE为缓冲液，紫外检测仪下观察结果。以PCR产物中出现348nt条带的样品为阳性。1．2．5PCR产物测序对PCR产物进行纯化测序。测序由上海生工测序部完成。1．2．6序列分析及进化树的绘制用DNAStar进行序列的比对，计算核苷酸序列的同源性，绘制基因进化树。2结果与分析2．1猪粪中HEVRNA的检测在1％琼脂糖胶上出现预计的348nt的条带(图6—1)为PCR产物阳性结果。12345Ml：阴性对照2-5：阳性扩增产物(348bp)M：DL2000Marker2000bp1000bp750bp500bp200bp100bp图6—1部分猪粪便样品HEVORF2RT．nPCR扩增结果Fi96一lHEVORF2RT-nPCRproductofpartialfaecalspecimensofswine在1％琼脂糖胶上出现预计的236nt的条带(图6．2)为PCR产物阳性结果。 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染2000bp1000bp750bp500bp250bplOObp■l234S6T图6．2部分猪粪便样品HEVORF2RT．nPCR扩增结果Fig6-2HEVORF2RT—nPCRproductofpartialfaecalspecimensofswine2．2不同猪场及不同月龄猪粪样本的检测结果表6．1不同猪场及不同月龄猪粪样本的检测结果Table6．1ThedetectingresultSofpigfecessamplesindifierentpiKfarmsandindifierentage●●■■■■■■■■■■■●■■■■■■■●■■■●●●■■■■■●■■●■■●■■■■■■■■●■●■●■■■■■■■■■■■●●■■■●●一M■■■●■■●●■●■●●●■●■一猪场月龄0～1月龄1～2月龄2～3月龄3～4月龄4．-一55～6人于6阳性阿I性率月龄数(％)份数0A阳性数0份数0B阳性数0份数0C阳性数0份数13D阳性数2份数2E阳性数0份数0F阳性数0份数16G阳性数1阳性数3刚性率(％)9．68040O70400100300713l5l05O211O2072729．1723．280O20310O122317．650O0O1O10O0O20183257O13412．0015．3817．525．023．3325．5822．2214．297．8418．4557m7¨474如¨8O0O0B28●0O¨03引9 试验研究第六章江西部分市县猪群猪戊型肝炎病毒RNA的检测2．3不同月龄段猪感染HEV的情况分析图6—3不同月龄段猪感染HEV的情况Fig6-3theHEVdetectingresultsofdifferentmonth’Sagepigfecessamples从图6—3可见，1月龄内及大于6月龄猪HEV感染率相对较低，但感染率比较接近，为9．68％与9．38％，此提示HEV存在垂直传播的可能性；1月龄内感染率上升，1—2月龄的感染率最高，2—3月龄的感染率维持较高水平，与国内外的一些报道基本一致；3月龄后呈现下降趋势，但5“月龄猪感染率出现小幅度升高，而后降低，此种情况可能为感染猪抗一HEV抗体水平下降后，部分猪出现再次感染现象。3讨论深入地研究猪群感染HEV的因素，对于搞清猪戊型肝炎的发病机理、阻断HEV的传播途径、减少人和猪感染HEV以及开发人猪通用的戊型肝炎疫苗具有重要意义。目前对猪戊型肝炎缺乏特效的治疗方法，也没有特异性被动和主动免疫制剂可供预防，控制猪戊型肝炎的关键是以切断传播途径为主的综合性防控措施。通过本试验结果可以推断：江西猪群感染HEV情况较严重，统计学分析表明江西猪群1月龄以内及大于6月龄的猪，HEV感染率相对较低，1月龄后感染率上升，1~2月龄的感染率最高，2～3月龄的感染率维持较高水平，这与国外报道在美国、台湾和日本大多数猪在2~3月龄感染HEV结果基本一致，3月龄后呈现下降趋势，但5“月龄猪感染率出现小幅度升高，而后降低，可能由于母源抗体滴度下降，出现再次感染的结果。不同猪场HEV的感染情况有差异，感染的严重程度又有所不同。有报道说明饲养条件较好的猪场HEV感染率较低，江西猪群HEV阳性率较高，说明江西猪场饲养卫生条件普遍较差，存在人HEV感染的隐患，故需要进一步改善猪场的卫生条件，这对预防HEV在人群中的感染具有很重要的公共卫生学意义。69¨∞们∞扣坩C 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猜群的混合感染参考文献[1]Wu．J．C，ChenC．M，ChiangT．Y，eta1．ClinicalandepidemiologicalimplicationsofswinehepatitisEvirusinfection[J】．J．M酣．Virol，2000，60(2)：166—171．[2]VanderPoelWH，VerschoorF，vailderHeideR，eta1．HepatitisEvirussequencesinswinerelatedtosequencesinhumans，TheNetherlands[J】．EmerInfectDis，2001，7(6)：970-976．[3]MengJ．，DaiX．，ChangJ．C．，eta1．Identificationandcharacterizationoftheneutralizingepitope(s)ofthehepatitisEvirus【J】．Virology，2001，288：203-11．【4】高桥雅春．戊性肝炎病毒研究的新进展【J】．．日本医学介绍，2005，26(6)：253-255．[5】ChoiI．S．，KwonH．J．，ShinN．R．，eta1．IdentificationofswinehepatitisEvirus(HEV)andprevalenceofanti-HEVantibodiesinswineandhumanpopulationsinKorea[J】．J．ClinMicrobiol，2003，41(8)：3602-3608．【6】TakahashiM．，NishizawaT．，MiyajimaH．，eta1．SwinehepatitisEvirusstrainsinJapanformfourphylogeneticclusterscomparablewiththoseofJapaneseisolatesofhumanhepatitisEvirus[J]．J．GenViml，2003，84(4)：851-862．70 试验研究第六章江西部分市县猪群猪戊型肝炎病毒RNA的检测TheDetectionofSwineHepatitisERNAinSomeCitiesandCountiesinJiangxiABSTRACT：InordertoinvestigateHEVinfectionsofpigherdsinJiangxi，swinefaecesspecimens∞2271)werecollectedfrom7scalepigfarmsinJiangxi．Ofwhich，40frompigfarmA，40frompigfarmB，30frompigfarmC，43frompigfarmD，18frompigfarmE，49frompigfarmF，51frompigfarmGrespectively．ThesespecimensweretestedforthepresenceofHEVRNAbyareversenestedtranscriptionpolymerasechainreaction(RT-nPCR)．TheresultsfromRT-nPCRshowedthat50outof271specimenswereHEVpositive，thatis，an18．45％totalpositiverate．TheHEVpositivespecimensforeachindividualpigfarmwereasfollows：pigfarmAWas7in40(17．5％)，pigfarmBwas10in40(25．O％)，pigfarmCWas7in30(23．33％)，pigfarmDwas1in43(25．58％)，pigfarmEWas4in18(22．22％)，pigfarmFWas7in49(14．29％)，pigfarmGWas4in51(7．84％)，respectively．Accordingtotheageofthepigs，thenumberofHEVpositivespecimensandpositiveratewereasfollows：0-1monthagewere3from31and9．68％，l—2monthagewere7from24and29．17％，2-3monthagewere27from116and23．28％，3~4monthagewere3from17and17．65％，4---5monthagewere3from25and12．00％，5-6monthagewere4from26and15．38％，morethan6monthsagewere3from32and9．38％，respectively．KEYWORDS：SwinehepatitisEvirus；Reversetranscriptionnestedpolymerasechainreaction；Detection7l 试验研究第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析摘要：为了解江西猪群感染猪戊型肝炎的基因型情况，对PCR扩增产物进行纯化并测序，利用分子生物学软件进行序列分析和进化树绘制，4个HEV试验毒株ORF2348nt同源性为92．1％～97．5％，为同一基因型，与HEVl、HEV2、HEV3同源性分别为70．7％～77．4％、72．5％～75．7％和71．6％～76．8％，与HEV4型的同源性79．2％～83．9％。5个HEV试验株ORF2210nt同源性为80．1‰97．7％，为同一基因型，与HEV3同源性为78。l‰82．8％，与HEV4型的同源性78．9％-95．9％；13个HEV试验株ORF2236nt同源性为80．4％---100％，为同一基因型，与HEVl、HEV2、HEV3同源性分别为68．5％～76．4％、70．6％～82．3．％和74．5％～83．7％，与HEV4型的同源性76．9％-90．8％。进化树进行分析表明22个试验毒株与HEV4型的代表株在同一分支上，属基因4型，表明江西猪群猪戊型肝炎病毒感染以基因4型为主。关键词：猪戊型肝炎病毒；RT-nPCR；基因型；分析戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)是一种经肠道传播的非甲．非乙型肝炎病毒，该病毒对人类健康具有严重的危害性。1983年前苏联病毒学家BaLagan等应用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为27nm--一30nm的病毒样颗粒，从而证实该病毒为一新型非甲一非乙型肝炎病毒。1989年东京国际会议被正式命名为hepatitisEvirus(HEV)。1990年Reyes等应用分子克隆技术得到了该病毒的基因克隆并进行了序列分析。研究证实戊型肝炎(HE)是一种人畜共患病，HEV可通过粪．口途径传播，经常会引起水型爆发或食物型爆发，导致戊型肝炎的发生，严重危害人类的健康。目前认为，戊型肝炎的传播途径为动物_÷人_人。此病毒呈全球分布，在一些卫生条件较差的发展中国家及地区曾多次发生爆发型流行，在发达国家，由于卫生条件较好，该病毒主要呈散发型流行。人对HEV易感，发病重病死率高，轻壮年病死率1％～2％，孕妇高达20％。此病毒是一种严重危害人畜健康的肝炎病毒，猪是HEV常见的中问宿主之一，其感染HEV常呈隐性过程，基本无症状，但在其感染过程中可排出HEV，污染环境导致人HEV的发生。为了解猪HE的分子流行病学，掌握其流行规律，根据HEVORF2的序列设计引物，目的片段分别是348nt、210nt和236nt，对22个试验毒株进行序列分析和基因型分析。 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染1材料与方法1．1材料1．1．1酶和其他试剂TRIzol为BBI产品，RNAPCRKit(AMV)Ver．3．0购自大连宝生物公司，PCR扩增试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DEPC、糖原购自上海生工，氯仿、异丙醇等其他试剂均为分析纯试剂，DNAMarkerDL2，000购自大连宝生物公司。1．1．2引物设计及合成根据GenBank的HEV序列从ORF2设计一套简并引物，预计目的片段预计的348nt，由上海生工合成。夕}、引物：A1：5'-AAT(C)TATGCC(A)CAGTACCGGGTTGA2：5’．CCCl’，rATCCTGCTGAGCArTCTC内引物：A3：5'-GTT(C)ATGC('I’)TT(C)TGCATACATGGCTA4：5'-AGCCGACGAAATC(T)}AATTCTGTC根据GenBank的HEV序列从ORF2设计另一套简并引物，预计目的片段预计的236nt，由上海生工合成。外引物：B1：5‘．CCGACAGAATTGArTTCGTCGGC．3‘B2：5‘一CCG眦GTCGACTGGTCGTACTC．3‘内引物：B3：5‘一GTTGTCTCGGCCAATGGCGAGCC一3‘B4：5‘．TCGGCGGCGGTGAGAGAGAGCCA一3‘根据GenBank的HEV序列从ORF2设计另一套简并引物，预计目的片段预计的210nt，由上海生工合成。外引物：C1：5'-CCA(G)ACAGAAG(T)TGATTT(C)CGTCGGC-3‘C2：5'-CCGTAA(G)GTCGA(C)CTGGTCG(T)TACTC一3‘内引物：C3：5'-GTTGTCTCGGCCAATGGCGAGCC．3‘C4：5‘．TCGGCGGCGGTGAGAGAGAGCCA．3‘1．1．3主要溶液的配制(同第六章)1．2方法1．2．1粪样品的处理(同第六章)1．2．2HEV基因组RNA的提取(同第六章)1．2．3RT-nPCR(同第六章)74 试验研究第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析1．2。4PCR产物鉴定(同第六章)1．2．5PCR产物测序对PCR产物进行纯化测序。测序由上海生工测序部完成。1．2．6序列分析及进化树的绘制用DNAStar进行序列的比对，计算核苷酸序列的同源性，绘制基因进化树。2结果与分析2．14个HEV试验株ORF2348nt序列和基因型分析4个HEV试验株ORF2348nt同源性为92．1％---97．5％，为同一基因型。与HEVl、HEV2和HEV3同源性分别为70．7％～77．4％，72．50／'0．．．75．7％和71．6％76．8％，与HEV4型的同源性79．2％二83．9％(表7．1)，对以该ORF2348nt片段绘制的进化树进行分析，4个分离株与HEV4的代表株T1在同一分支上(表7—2)，属HEV4。此外，与中国大陆6株猪源HEV比较，同源性为79．0％一87．3％(表7．3)。表7-1HEVORF2348nt核苷酸序列同源性比较Table7—1NucleotideidentityofHEVORF2348nt表7．2DNAStar分析核苷酸同源性结果Table7-2AnalysisaboutnueleotideidentitybyDNAStarsoftwarePercentIdentity12345678g10111213t4t5'617181l■l95．597．593679．280．772571．97’972271671671．979．570．772．272．57’．91swJXll21．6■一97．592．180．181．672．571．672．873．171671．671．979．270771．673●71．92swJX3231，013_i95g82．683375．174．475．475775’75．175．483．97417l，475．775．43swJX5443．24．22．2{●|83．882．076875976．877．476．814．777．181．476．273．277．14swJXZ6519．418．818．7lI85．279．881。379．479。575．275．079．O85．378．878，97e．879．55T1618819．118．21e．217．0_79．379．579．779879．479．579．293．779．279．377．879．46T21730．430．329．226．924．0243●91．979．179．279378．878．479．479．07e．279．07USl831331329．729．321．824．28．4{_79．679479．479479378．479．779．579．28US2929．428．e27828．024．324．224．723．9_i98．594394494．080．294．197n81．293，89日11029．028_327．327．024．224．124．724．21．5_93．693593．380．593．696181．193．'10B21131．030．428．928．057125．024．524．26．16，8_；98．798．179．093．993．081．408．311C21230．529．929428．557．224．924．324．25．96．91．3—I97．979．394．0932引．198．1t2C31330．529．928．427．524925．325．024．363711．9Z．1■_i，￥．U93．993．3B1．197．413C41418919．218．7'e．816．96．725625．523．423025124725．1蛋■■79．980579．679．914CH·H-F．21532031．930．328g25325．224223．B626日646．46．S23．7曩■雕93581193．715111631．030929328925，125124924．031417．57．37．123．O69l_I81193．016121730．129529030．625．126．625124．222．022121822222．125．5223’’1曩_lR1E17MeK-141830．429．B28．327．524．225024824．56．57．31，71．92．623．86．67．521．5曩■；18P112345678g10111213141S16171875 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染252D151050NucleotideSubstitutions(xl00)图7—1HEVORF2348nt核酸序列的进化树Fi97—1Phylogenetictreeofpartialnucleotidessequence(348bp)fromHEVORF2Note：HEVl：C2，C3，C4，PI，11，12，B1，B2．HEV2：MEX．14．HEV3：USI．US2．HEV4：TI，1"21，CH—H-F-2表7．34个江西HEV试验株与中国大陆6株猪源HEVORF2部分核苷酸序列比较(％)Table7-3ComparisonofpartialORF2sequenceof4SHEVwith6reportedSHEVisolatesofChinaPercentIdentity1234S678910195．597．593．680．779．O79．282．779．078．71swJXll22．297．592．181．079．080．183．380．779．02swJ×3231．32．095．g83．079．382．683．079．33swJX5443．94．92．281784．083．887．383．380．34swJX76517．918．317．517．gI84．385．385．091．35Ch．S．5619．921．31g．519．718．486．385．086．383．76SJI4718．818．818．419．616．915．887．799．386．77swCHl00814．715．514．314．217．417．514．087．786．08SHl920．01g．g1g．61g．717．515．80．714．0815．79G8101g．320．618．820．09．51g．315．216．015．210SB21234567891076 试验研究第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析2．25个HEV试验株ORF2210nt序列和基因型分析5个江西HEV试验株ORF2210nt同源性为80．1％"97．7％，为同一基因型。与HEV3同源性为78．1％'--82．8％，与HEV4型的同源性78．9％---95．9％(表7．4)，对以该ORF2210m片段绘制的进化树进行分析，5个江西HEV试验株与HEV4的代表株T4在同一分支上，属HEV4。表7-4DNAStar分析核苷酸同源性结果Table7-4AnalysisaboutnucleotideidentitybyDNAStarsoftwarePercentIdentity234．1———T————T————T————．r——]200150100500NucleotideSubstilutions(xl00)图7-2HEVORF2210nt核酸序列的进化树Fi97-2Phylogenetictreeofpartialnucleotidessequence(210bp)ffomHEVORF2Note：T1：China1HepatitisEvirusgenes(GenBank：L25547．1)T2：Mexicanstrain(GenBank：M74506．1)T3：HepatitisEvirustype3，HEWSW／NL／2005．1055(GenBank：EU526647．I)T4：HepatitisEvirustype4，HE-JF3(GenBank：AB220971．1)77J1^，‘，3i4^j脚珊脚脚H脚n髓W 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染2．313个江西SHEV试验株ORF2236nt序列和基因型分析13个江西SHEV试验株ORF2236nt同源性为80．4％～100％，为同一基因型。与HEVl、HEV2和HEV3同源性分别为68．5％---76．4％，70．6％82．3％和74．5％～83．7％，与HEV4型的同源性78．8％-90．8％(表7．5)，对以该ORF2236nt片段绘制的进化树进行分析，13个江西SHEV试验株与HEV4的代表株T1在同一分支上(表7—5)，属HEV4。表7-5DNAStar分析核苷酸同源性结果∞UC∞a■’∞．三oTable7-5AnalysisaboutnucleotideidentitybyDNAStarsoftwarePercentIdentity．．——12345678910111213141_|90．890．792．393．092．495．996．090．294．490．094．68771JX0817657(26)24．3_|89-784。887．183．594，794．994．791．694．787。986．386．92JX0817658(2)35．51．1ll90．792．592．392．694．293．686．489．690．094．988．93JX0913200(206)44．71．42．8l{94．191．893．495．294．484．290．789．893．887．54JX0913202(236)55．62．02．53．6l_93．894．196．095．285．991．191．694．490．35JX0913204(273)64．90．82．02．32．6l匪95．595．586．191．288．794．18726JX0913206(277)74．20．01．11．42．20．8‘_i98．2100．O93296．591．195．788．97JX0913208(230)84．20．01．11．42．20．80．0|■I99．294．698．493．097．690．88J×0913212(241)94．10．01．11．42．20．8O．00．0ll|94．397．692．296．890．09J×09291815(120104．70．01．21．52．40．90．00．0_；80．482．987．578．810JX09291816(58)114．40．01．11．42．30．80．0—88．192．785．B'1J)(09291817(23)126．82．33．13．83．43．22．22．42．3_92．586．412J×09291818(87)133．90．60．82．02．21．40．6050．50．30．62．3l孤313J)(0929t819(1111413．715．711．611．811．611．210．810．610．715．411．012．810．6|ll14T11234567891011121314表7-6HEVORF2236nt核苷酸序列同源性比较Table7．6NucleotideidentityofHEVORF2236nt鱼曼坠旦堡巳曼坚垦∑!婪曼∑兰婪曼∑三旦垦∑兰!!!兰壁!型竺13Isolates68．5—76．470．6．82．374．5．83．776．9．90．880．4—100HEV475．2．80．778．5．79．375．I一78．790．2HEV3HEV2HEVl75．9．78．872．0．77．691．9．93。176．5—79．994．3．100 试验研究第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析19．8'■1●1一'，10I-‘曩●NucleotideSubstitutions(x100)图7-3HEVORF2236nt核酸序列的进化树Fi97—3Phylogenetictreeofpartialnucleotidessequence(236nt)fromHEVORF2Note：HEVl：C2，C3，C4，PI，II，12，BI，B2．HEV2：～IEX．14．3讨论HEV3：USl，US2．HEV4：T1，T21，CH⋯HF23．1关于4个江西SHEV试验株ORF2348nt序列和基因型分析4个江西SHEV试验株ORF2348nt同源性为92．1％‰97．5％，为同一基因型，与HEVl、HEV2和HEV3的同源性分别是70．7％～77．4％，72．5％一75．7％和71．6％～76．8％，与HEV4的同源性达79．2％～83．9％，因此，提示该4个江西SHEV试验株属于HEV4型，同时对该区域的基因进化树进行分析，其结果与核苷酸同源性的 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染结果相同，4个江西SHEV试验株与HEV4型的代表株T1在同一分支上，T1株来自中国急性戊肝患者，这与国内外报道各国猪源HEV与本国人HEV的同源性都很高相一致【11，进一步从基因水平佐证戊型肝炎是一种人畜共患的传染病。另外与中国大陆6株猪源HEV比较，同源性为79．0％．87．3％，由于这6株分别来源于中国大陆浙江、河南、北京、吉林和新疆，因此可以推测中国大陆猪源HEV基因型单一且一致，同属于HEV4型，或者至少可以推测HEV4型是我国猪源HEV的主型。有报道说中国大陆的HEV为HEVl和HEV4型，但是近年来关于发现HEVl型的报道很少，在猪上发现的分离株竟然全部都是HEV4型，猪是否也感染HEVl型需要进一步研究。程险峰等【21发现HEV4型比HEVl型变异程度更高，而且随着时间的推移变异程度增大，故密切监视各地HEV4型的基因变化状况具有非常重要的意义。鉴于猪可能为HEV的宿主，应严格控制猪等动物污染水源，以免造成HEV的爆发或流行。3．2关于5个江西SHEV试验株ORF2210nt序列和基因型分析HEV基因分型目前尚无统一标准，用于HEV基因分型的区段应具备三个基本条件：①该区段存在一定变异程度，可以替代全基因序列进行基因分型；②该区段侧翼序列保守，易于设计PCR引物用于不同变异程度的HEV扩增，且设计的引物能够在实际工作中同时扩增出不同基因型HEV毒株的基因片段；③该区段的核苷酸序列应达到一定的长度，以使基于遗传距离所构建的系统进化树具有较好的可信度。一般来说，HEV分4个基因型，分别为HEVl、HEV2、HEV3和HEV4型，在进行引物和探针的设计时考虑到检测的广泛性、通用性和敏感性，为此在HEVORF2部位的保守区来设计引物，其中上游引物设计几个兼并碱基。李峰等13J提出我国HEV流行趋势由HEVl型为主经HEVl与HEV4型混合到以HEV4型为主，并对以检测的HEV样本分出HEV4型的亚型，我国HEV4型分布复杂，与以往的地域保守性有所不同。5个江西SHEV试验株ORF2210nt与HEV3型同源性分别为78．1‰82．8％，与HEV4的同源性78．9％95．9％，测序的结果与HEV4同源性最高，经BLAST比对后的结果一致。本试验PCR产物直接送生物公司单向测序，前端有20个左右碱基信号不准确，目标扩增片段为236nt，测序后结果在202nt～213nt之间，故选择ORF2210nt作为比对核苷酸序列同源性和基因进化树的标准，最终的分析片段还是较短，在210nt左右的样本总量中，如果出现扩增或者测序误差，对结果也是会有一定的影响，所以同源性会出现较大的波动。80 试验研究第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析3．3关于13个江西SHEV试验株ORF2236nt序列和基因型分析HEVl型主要来自亚洲和非洲，HEV2型以墨西哥株为代表，HEV3型以美国株为代表，HEV4型来自中国大陆、中国台湾和日本。13个江西SHEV试验株ORF2236m同源性为80．4％-100％，为同一基因型，与HEVl、HEV2、HEV3同源性分别为68．5％～76．4％，70．6％～82．3％和74．5％～83．7％，与HEV4型的同源性78．8％～90．8％，因此该13个江西SHEV试验株属于HEV4型，同时对基因进化树进行分析，其结果与核苷酸同源性的结果相同，13个江西SHEV试验株与HEV4型的代表株T1在同一分支上，T1株来自中国急性戊肝患者，这与国内外报道各国猪源HEV与本国人HEV的同源性都很高相一致，进一步从基因水平证实戊型肝炎是一种人畜共患的传染病。而且随着时间的推移变异程度增大，故密切监视各地HEV4型的基因变化状况具有非常重要的意义。鉴于猪可能为HEV的宿主，应严格控制猪等动物污染水源，以免造成HEV的爆发或流行。81 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染参考文献[1]TakahashiM，NishizawaT，MiyajimaH，eta1．SwinehepatitisEvirusstrainsinJapanformfourphylogeneticclusterscomparablewiththoseofJapaneseisolatesofhumanhepatitisEvirus[J]．JGenVirol，2003，84(4)：851-862．[2】程险峰，戴星，孟继鸿，等．南京地区戊型肝炎病毒基因型鉴定和变异分析【J】．中国病毒学，2005，20(5)：468-471．[3】李峰，孟继鸿，董晨，等．戊型肝炎通用PCR引物设计与基因型分析【J】．病毒学报，2009，20(1)：9—15．82 试验研究第七章江西猪群感染猪戊型肝炎病毒的基因型分析TheGenotypeAnalysisofSwineHEVsInfectingPigHerdsinJiangxiABSTRACT：ThePCRproductscovenngdifferentlocationsofORF2ofHEVwerepurifiedandsequenced，andthenthesequenceswereanalyzedbyDNAStarLasergenev8．0(DNASTAK,Inc．)．AphylogenetictreewasgeneratedbyMEGA4software．nleidentityof348ntnucleotidesequencesoffourswineHEVisolatesrangedfrom92．1％97．5％whencomparedwitheachother,fallinginthesamegenotype．TheseswineHEVhad70．7％～77．4％，72．5％-75．5％，71．6％-76．8％，79．2％～83．7％nthomologtohumanHEVl，HEV2，HEV3，andHEV4，respectively．Theidentityofnucleotidesequencesof210ntfragmentspcifictoORF2of5swineHEVisolatesrangedfrom80．1％to97．7％，fallingintothesamegenotype．TheseswineHEVshad78．1％82．8％and78．9％95．9％nthomologytohumanHEV3andHEV4．Likewise，Theidentityofnucleotidesequencesof236ntwithintheORF2of13swineHEVisolateswas80．4．1％100％．belongingtothesamegenotype，andtheyhad68．5％-76．4％，70．6％～82．3％，74．5％～83．7％and76．90／o~90．8％nthomoIogtohumanHEV1，HEV2，HEV3，andHEV4，respectively．Phylogeneticanalysesfurtherrevealedthatthese17swineHEVisolateswerecloselyrelatedtoHEVT1strain，andbelongedtoHEVgenotype4，indicatingthatswineHEVsfromJiangxianalyzedinthisstudywerethesamegenotypecirculatinginotherareasandbelongedtoHEVgenotype4．KEYWORDS：SwineHepatitisEVirus；Reversetranscriptionnestedpolymerasechainreaction；Genotype；Analysis83 试验研究第八章猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒混合感染的检测与分析第八章猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒混合感染的检测与分析摘要：为了解猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒是否存在混合感染的情况，对90份病猪血清样品先进行PCV2检测，阳性58份，阳性率64．44％(58／90)；对这58份PCV2Pfl,}生的血清样品再进行HEVRNA的检测，阳性6份，阳性率6．67％(6／58)。136份疑似感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)先进行PCV2检测，阳性124份，阳性率91．18％(124／136)；再进行HEVRNA检测，阳性19份，阳性率13．97％(19／136)。结果证实猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒存在混合感染，疑似病料混合感染率13．24％(18／136)，疑似血清混合感染率6．67呶6／90)，平均混合感染率10．62呶24／226)。关键词：猪戊型肝炎病毒；猪圆环病毒2型；混合感染；检测；分析猪圆环病毒病与猪戊型肝炎都是免疫抑制性疾病，感染过程称中一般都具有慢病毒感染的特征，自身体内很难清除病毒，在漫长的感染过程中，不断地向外界排出病毒，继而传播病毒到其他健康动物。HEV与PCV2的感染有许多相似之处：两者感染一般都呈阴性感染的过程，无明显症状，都能破坏机体免疫力，使机体更容易继发其他细菌或者病毒感染。本试验研究将所采取的病料，先进行PCV2检测，在PCV2阳性病料的基础上，再进行HEV的检测，以探索猪圆环病毒与猪戊型肝炎病毒是否发生共感染。1材料与方法1．1材料1．1．1酶和其他试剂(同第三、六章)1．1．2引物设计及合成(同第三、六章)1．1．3主要溶液的配伺(同第三、六章)1．2方法1．2．1粪样品的处理(同第三、六章) 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染1．2．2组织匀浆及PCV2DNA的提取(同第三章)1．2．3HEV基因组RNA的提取(同第六章)1．2．4PCV-2PCR(同第三章)1．2．5HEVRNART-nPCR(同第六章)1．2．6PCR产物鉴定(同第三、六章)1．2．7PCR产物测序对PCR产物进行纯化测序。测序由上海生工测序部完成。2结果与分析2．1血清和病料PCV2阳性检测结果来自江西不同市县猪群136份疑似感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)进行PCV2检测，结果PCV2阳性124份，阳性率91．18％(124／136)。90份疑似感染血清进行PCV2检测，结果PCV2阳性58份，阳性率64．44％(58／90)。2．2血清和病料HEVRNA检测结果来自江西不同市县猪群136份疑似感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)进行HEVRNA检测，HEVRNA阳性19份，阳性率13．97％(19／136)。90份疑似感染血清进行HEVRNA检测，结果HEVRNA阳性6份，阳性率6．67％(6／90)。2．3HEV与PCV2混合感染检测结果58份PCV2阳性血清同步HEVRNA的检测，结果HEVRNA阳性6份。表8—1血清HEV与PCV2混合感染的检测结果Table8-1theco-infectionresultsofHEVandPCV2inserum表8—2病料HEV与PCV2混合感染的检测结果Table8—2theCO—infectionresultsofHEVandPCV一2indiseasedspecimens86 试验研究第八章猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒混合感染的检测与分析结果证实猪圆环病毒与猪戊型肝炎病毒存在混合感染，疑似感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)混合感染率13．24％(18／136)，疑似感染血清混合感染率6．67％(6／90)，平均混合感染率10．62％(24／226)。3讨论3．1结果显示江西不同市县猪群HEV与PCV2存在混合感染现象，PCV2的感染现象较为严重，各个月龄段的HEV与PCV2感染率有所不同。3．2在136份疑似感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)中，同时检测出HEV与PCV2阳性的样品数为18份，HEV阳性而PCV2阴性的样品数为1份，HEV阴性而PCV2阳性的样品数为106份，HEV与PCV2均为阳性的样品数为11份。3．3猪圆环病毒与猪戊型肝炎病毒存在混合感染破坏了机体免疫力，机体免疫力下降后，使机体更容易继发其他细菌或者病毒感染，如猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)、细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HP)、猪肺炎支原体(MH)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)和多杀性巴氏杆菌(PM)等，而造成大规模或者较为严重的感染疾病，使死亡率大大升高。 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染DetectionandAnalysisofCo—infectionsofHEVandPCV2ABSTRACT：ToelucidatetheCO—infectionsofHEVandPCV2inpigherdsinJiangxi，atotalnumberof90bloodsamplesfromdiseasedpigswereinitiallyexaminedforPCV2．Theresultsshowedthat58outof90specimens(64．44％)werePCV2positive．Subsequently,these58PCV2DNApositivespecimensweretestedforHEVRNAbyRT-PCR，andfound6in58wereHEVpositive，thatisa6．67％CO—infectionrate．Additionally,136tissuesamplestakenfromdiseasedpigsweredetectedforthepresenceofPCV2DNA，andtheresultsrevealedthat124in136werePCV2positive，thatis，、ⅣimaPCV2positiverateashighas91．18％．ThesespecimenswerethentestedforHEVRNA，theresultsshowedthat19outof136specimens(13．97％)wereswineHEVpositive．Tosummary,theresultsofthestudydemonstratedthattheCO—infectionratefromthetestedseraandtissue／organsampleswas6．67％and13．97％forswinePCV2andHEV,respectively,i．e．，a10．62％averageCO—infectionrate．KEYWORDS：SwineHepatitisEVirus；Porcinecircovirustype2；Co—infection；Detection；Analysis88 试验研究第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析摘要：根据GenBank中已发表的序列和参考有关文献，分别设计合成针对猪伪狂犬病病毒(PRV)gD基因和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的特异性引物，建立检测这两种DNA病毒的多重PCR方法，可同时扩增出217bp和404bp相应目的片段。同时，分别设计合成针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因和猪瘟病取HCV)E2区基因的特异性引物，建立检测这两种RNA病毒的多重RT-PCR方法，可同时扩增出372bp和375bp相应目的片段。应用建立的两种多重PCR方法，对来自江西省猪群的253份临床病料进行检测，结果显示PRRSV阳性215份，阳性率85．O％(215／253)；CSFV阳性143份，阳性率56．52％(143／253)；PCV2阳性93份，阳性率36．76％(93，253)；PRV阳性6份，阳性率2．37％(6／253)。PRRSV和CSFV双重感染103份，阳性率40．71％(103／253)；PRRSV和PCV2双重感染53份，阳性率20．95％(53／253)；PRRSV和PRV双重感染2份，阳性率0．79％；PCV2和HCV双重感染11份，阳性率4．35％(11／253)；PCV2和PRV双重感染1份，阳性率0．4％(1／253)。PRRSV、CSFV和PCV2三重感染26份，阳性率10．28％(26／253)；PRRSV、PCV2和PRV三重感染l份，阳性率0．4％(1／253)。PRRSV、CSFV、PCV2和PRV四重感染l份，阳性率0．4％(1／253)。关键词：猪圆环病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪伪狂犬病病毒；猪瘟病毒；混合感染2001年6月以来，在我国江苏、山东等地发生一种急性传染病——“猪高热病"【lJ，后来的研究证实为“猪高致病性蓝耳病”。此后每年不同地区都有该病的报道12~引，但没有引起养猪业方面的重视。直到2006年5月，该疫情突然爆发于江西、江苏、浙江、湖南、广东乃至于全国t5。15。。2007年3月，该疫情又在广东、广西、贵州、重庆等地再次爆发ll6‘，给养猪业造成巨大的损失。该疫病以病猪全身发红、高热稽留、食欲下降、呼吸困难、母猪流产等为特点，可感染不同年龄、性别和品种的猪，一年四季均可发生，以高温季节更为多发，传播快，发病率高，死亡率随病程和继发感染的严重程度而异。虽然高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒被确认为该病的主要病原，但在该疫病的流行病学调查和临床诊断上发89 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染现临床病例中猪瘟和猪圆环病毒2型等病毒。为此，本研究采集了江西省及周遍地区2006年7月至2007年12月期间的253份拟似“猪高热病”病料，通过建立PCR和RT-PCR方法，对所采病料进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒四种病毒的检测分析，以期为该疫病的防控提供一定的理论参考资料。1材料与方法1．1病料的收集与处理253份临床病例的病料，分别收集于2006年7月份N2007年12月份，来自于江西省以及周边地区的发病猪场(具体情况见表9．1)。采集病死猪的肺脏、脾脏、肾脏、淋巴结、扁桃体等器官，．20℃保存备用。表9．1253份病料基本情况Table9．1BaSicinformat．onof253issues从表9．1中可以看出，收集的病料以保育猪和育肥猪为主，共计206份，占病料总数的81．43％。1．2阳性病料PRRSV、HCV、PCV2和PRV的阳性猪病料均由江西农业大学兽医院提供。l-3分子生物学试剂TaKaRaDNAPCR扩增试剂盒，饱和酚、胃蛋白酶K、EB均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Vet3．0购自大连宝生物工程有限公司，DNAMarkerDL2000、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DEPC、EB购自上海生工生物工程技术服务有限公司，异戊醇、醋酸钠、氯仿、无水乙醇、异丙醇等其它试剂均为分析纯试剂。。 试验研究第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析1。4检测PCV2和PRV的PCR方法1．4．1引物设计参考GenBank中已发表的猪PCV．2核酸序列(序列号：AY29310)和猪PRV的gD基因序列(序列号：AYl96984)以及有关文献，利用计算机辅助软件Oli906．0设计两对特异性的PCR弓I物，引物序Y,J女n下：P1：5’一TAATTAGCGGACTTCCGCAG一3’P2：5’一ACTCGGTrGTGCGTGAGAT一3’P3：5，-GACGGTAGGACGAGCTGGGCC■3’P4：5’．CTCCACGCGCGGCCCCTTGAAGCT-3’引物P1、P2为扩增PCV．2的ORF2基因的特异性引物，扩增片段长404bp：引物P3、P4为扩增PRV的gD基因的特异性引物，扩增片段长217bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，稀释浓度为25pmol／L，分装保存于一20℃。1．4．2病毒DNA的提取用天根生化科技有限公司的DNA提取试剂盒提取病毒的总DNA，提取后的DNA用40此灭菌双蒸水溶解，立即使用或．20"C保存备用。1．4．3PCR反应体系PCR反应组成如下：10xPCRBuffer，5此；MGCl2(25mmol／mL)，3．0tlL此；DNTPs(10mmol／mL)，l皿；TaqDNA聚合酶，O．5此；PWl(25pmoFpL)，1此，PW2(25pmol／laL)，l此，；DNA模板，5此；ddH20，33．5此。将上述反应液加入到PCR反应管中，轻轻混匀。PCR反应程序：94。C预变性3min；94。C变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；最后72。C再延伸10rain。反应结束后将PCR产物于4"C保存。1．5检测PRRSV和HCV的RT-PCR方法1．5．1引物设计参考GenBank公布的VR2332(美洲代表株，序列号：AY032626)和LV(欧洲代表株，序列号：AY588319)以及中国猪瘟兔化弱毒C一株(序列号：AY651061)E2区基因设计合成了两对特异性PCR引物，引物序列如下：Tl：5’(GCGCATCGATGCCAAp汀AACAAC)3’T2：5’(ACCTGGAGTCATGCTGAGGGTGA)3’T3：5’．CGCGTCGACCGTTACTAGGCATCATTG一3’T4：5’．ATGCTGCAGCCGCAACATACAGTAGA．3‘91 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染引物Tl、他为PP,RSV的特异性引物，片段跨幅为整个ORF7，长372bp；引物T3、T4为HCV的特异性引物，片段跨幅为A／D抗原区，长375bp。引物上海生工生物工程技术服务有限公司合成，稀释成浓度为259mol／L，分装保存于．20。C。1．5．2病毒RNA的提取用TaKaRa公司Trizol抽提试剂盒抽取病毒总融妊，提取的RNA用20pLDEPC处理的去离子水溶解，立即使用或．20℃保存备用。1．5．3RT．PCR反应体系RT反应组成：5xRTBuffer，2．0gL；dNTPs(各10mmol／L)，1．01．tL：Oligodt—Adaptorprimer，0．5pL；RnaseInhibitor，0．5lxL；AMVReverseTtanscriptase，1．0gL；RNA，5．0此；Total，10．0此。RT反应条件：42℃，30min，99℃，5min，5"C，5min，共一个循环，反应在PCR扩增仪(PE9600)上进行。合成的eDNA立即使用或一206C保存备用。PCR反应组成：5xPCRBuffer，109L；TaKaRaExTaqHS，O．51xL；PWI(25pmol／ItL)，lgL；PW2(20pmol／pL)，1此；RT模板，5此；ddH20，32．59L，Total509L。反应条件：95"C预变性5min；95。C变性lmin，52。C退火lmin，72。C延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后将PCR产物于4"C保存。2结果2．1扩增产物的鉴定2．1．1PCV．2和PRV的PCR扩增PCR扩增产物经l％琼脂糖凝胶电泳观察结果如图9一l和图9．2，可见用所建立的PCR方法扩增出7404bp和217bp的核酸条带。 试验研究第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析1000bp750bp500bp250bp100bp图9．1PCV2的PCR扩增结果图9．2PRV的PCR扩增结果Fi眇一1TheamplifiedresultsofPCV2byPCRFi99—2TheamplifiedresultsofPRVbyPCRl：阴性对照；2．3：PCV-2的阳性病料；M：DNAMarker．1：阴性对照；2．3：PRV的阳性病料；M：DNAMarker．1：Negativecontrol；2—3：PostiveissuesofPCV2；l：Negativecontrol；2—3：PostiveissuesofPRV；M：DNAMark2．1．2PRRSV和CSFV的RT．PCR扩增RT-PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果如图9．3和图9．4，可见用所建立的RT-PCR方法扩增出了372nt及375nt的核酸条带。20档bD1000bI{勰25‰l溉l：：=图9-3PRRSV的PCR扩增结果Fig．9-3TheamplifiedresultsofPRRSVbyPCR1：阴性对照：2-3：PRRSV的阳性病料；M：DNAMark．1：Negativecontrol；2·3：PostiveissuesofPRRSv；M：DNAMark2．2扩增片段的特异性鉴定2000bpiOoobP750b矗5∞《250bp100bp图9-4CSFV的PCR扩增结果Fig．9-4TheamplifiedresultsofCSFVbyPCRl：阴性对照；2．3：CSFV的阳性病料；M：DNAMark．1-2：PostiveissuesofHCV；Negativecontrol；M：DNAMark对临床组织病料PCV2与PRV毒株的PCR扩增阳性产物，PRRSV与HCV毒株的RT—PCR扩增阳性产物纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，基因序列长分别为404bp、217bp、372nt、375nt，对所测序列进行同源性分析，发现分别与GenBank中已发表的猪PCV．2核酸序列(序列号：AY754018)同源性为96％、与GenBank@已发表的猪PRV的gD基因序列(序列号：BK001744)同源性为96％、与93一攀瓣～ 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染GenBank中已发表的猪PRRSV核酸序列(序列号：AY032626)同源性为95％、与GenBankqh已发表的猪CSFV的基因序列(序列号：DQ480515)同源性为98％左右。说明扩增产物具有良好的特异性，试验建立的方法进行临床组织病料中PCV2、PRV、PRRSV和CSFV的检测是可行的。2．3检测结果与分析2．3．1单一病毒感染的检测结果表9-2253份病料检测结果统计表Table9-2Thedetectingresultsof253issues从表9—2可以看出，PRRSV、CSFV、PCV2、PRV的阳性率分别为85．00％、56．52％、36．76％、2．37％，其中PRRSV的阳性率最高，PRV阳性率最低。可以推测PRRS在猪群中普遍存在和流行，是当今养猪业中要重点防控的疫病。CSFV和猪PCV2的阳性感染率也比较高，说明这两种疫病在临床上也起到重要作用，要加强防控，不能放松警惕。此外，PRV的感染率非常低，说明目前对该病的防控措施是比较有效的。2．3．2病毒混合感染的检测结果表9．3253份病料中各病毒之间混合感染情况统计表Table9．3Mixedinfectioninfonnationbetweenthevirusin253issues 试验研究第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析从表9．3可以看出，PRRSV和CSFV的混合感染阳性率最高，253份病料中有103份，占总数的40．71％；第二混合感染阳性率高的是PRRSV和PCV2，占总数的20．95％；第三混合感染阳性率较高的是PRRSV、PCV2和CSFV的三重混合感染，有26份为，占总数的10．28％。CSFV与PCV2的混合感染率不高，占总数的4．35％。此外，PRRSV与PRV混合感染的病料有1份；PCV2与PRV的混合感染阳性率为0．79％；PRRSV、CSFV和PRV的三重混合感染阳性率为0．40％；CSFV、PCV2与PRV的三重混合感染阳性率为0．40％。另有1份四种病毒混合感染的病料。值得注意的是，从表9．3中可以得出CSFV、PCV2和PRV的感染均以混合感染的形式发生，没有单独感染的病料，而PRRSV则出现单独感染致病，PRRSV单独致病的有29份。2．3．3不同发育阶段的感染检测结果表9_4病猪各个发育阶段感染检测结果!生!￡2兰!垒呈垒曼堕里垫垒!曼堡!坚!堡21∑竺!旦堕堂∑皇!竺P竺!翌堕!兰竖兰竺!兰i!笙P!壁一PRRSv阳性率CSFV阳性率PCV2阳性率PRV阳性率发育阶段数量(％)从表9．4中数据可以得出，PRRSV在肥育猪阶段和流产胎儿病料中阳性感染率最高，在其它阶段也较高；CSFV在哺乳仔猪阶段病料中阳性感染率最高，PCV2在保育猪阶段病料中感染率较高，PRV多在猪的妊娠阶段发生感染，同时也说明这四种病毒均能导致母猪的繁殖障碍发生。3小结与讨论3．12006年5月以来，在江西、湖南、浙江等地的猪场，先后发生一种高热、厌食、黄尿为特征的疫病。疫病流行范围广，发病率和死亡率很高。在一个猪场内往往先有几头猪发病，几天内迅速波及全群，各种年龄、品种、性别的猪都可发生。调查发现本病发生往往与猪只的流动、免疫、应激因素等有关。饲养管理差、猪群密度大、防疫意识差的养殖户的猪场发病率高，死淘率高。目前，多数专家认同该病是由多个病原混合感染的结果。因此我们建立了猪圆环病毒2型与猪伪狂犬病的PCR检测方法和猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒的RT-PCR检测方法。3．2猪繁殖与呼吸综合征病毒主要引起怀孕母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道95 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染症状，自1987年首次报道以来，已经形成全球性流行并造成巨大的经济损失【17】。该病的病原为PRRSV，随着毒株的变异，新的强毒株不断出现，并能引起免疫过的猪发病，而且人工致弱的疫苗也出现毒力返强而引发临床疾病【18】。据宁宜宝等【19】报道，猪在感染PRRSV7d后进行猪瘟疫苗接种，13d后接种HCV野毒，结果发现PRRSV感染猪体内存在CSFV野毒，而对照组没有HCV野毒，说明了PRRSV对于CSFV免疫的干扰。由于PRRSV具有免疫抑制作用，所以猪一旦感染该病毒，就会引起猪群免疫功能下降，抵抗力减弱，疫苗接种失败，从而继发其它疾病。猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和猪圆环病毒病都是免疫抑制性疾病【20’到】，它们的病原都可以不同程度的损伤机体的免疫功能，降低机体的抵抗力，为继发或并发其它病原微生物创造了条件，这可能是混合感染多发的原因。3．3从PRRSV的感染情况来看，在哺乳阶段比其它阶段感染率低，推测可能是母源抗体的作用结果，随着母源抗体水平在猪体内的下降，PRRSV的感染率也逐渐上升。从实验数据来看，PRRSV存在单独感染致病的病例，阳性感染率非常高，说明PRRSV在“猪高热病”的流行过程中起着主导作用，对该病毒的防治将成为今后养猪业的首要任务之一。3．4PCV2具有致病性，与猪的多种新的传染病——断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、仔猪先天性震颤、猪心肌炎和繁殖障碍综合征等密切相关。猪是PCV2的天然宿主，各种年龄、不同性别的猪都可以感染，但以哺乳期和育成期的猪最易感，尤其是5～12周龄的断奶仔猪【22】。有资料显示某些地区商品猪带毒率已经超过50％，猪却并不发病【23、241。带毒猪长期排毒，威胁其他猪的健康，且发病猪只缺乏典型的临床症状与病理变化，难于诊断，这些都为该病的防控带来难度。目前普遍认为猪圆环病毒病是免疫抑制性疾病，能损伤猪免疫功能，影响猪的各种疫苗的使用效果，从而容易引起其它疾病的继发感染。3．5PRV所面临的主要困难是PRV的潜伏感染问题，感染猪康复后往往会长期带毒，且有排毒的危险，在机体受到体内外因素的刺激时，病毒往往被活化，并由带毒动物传给其他动物，引起疾病暴发。刘道新等通过血清学调查发现，猪的PRV的隐性感染比较严重，占所检测猪场总数的67．64％1251。目前，PRV基因缺失疫苗的使用，对该病的防控发挥了重要作用，但由于免疫程序不合理、生物安全措施不当等原因造成该病有流行的趋势。3．6近年来，我国猪瘟的流行和发病特点已发生了很大的变化，其流行形式，以温和型猪瘟为主，已从频发的大流行转变为周期性、波浪性的地区性散发性流行，通常3至4年一个周期，疫点减少，多局限于所谓“猪瘟不稳定地区”的散发性流行。在发病特点上，出现了所谓非典型猪瘟、温和型猪瘟和无名高热，部分病例症状病变不 试验研究第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析典型，又多混合感染其他病原微生物，这些都为临床诊断带来难度，必须依赖试验室诊断才能确诊。3．7由于PCV2的疫苗效果临床上反映不一，PRRSV的疫苗种类也较多，从PRRS的防控情况来看，目前有关PRRSV的疫苗效果在临床上并不很理想，而且PRRSV毒株存在变异；CSFV存在野毒感染，并且这3种病毒都可引起免疫抑制，一旦发生感染，必然影响其它疫苗的免疫效果，甚至有可能弱毒疫苗毒力返强。通过试验数据的分析，发现四种病毒在猪不同的发育阶段感染率有所不同，因此在猪的疫病防控上，可以适当地把握时机，在猪的不同发育阶段，有目的重点地防控感染率相对较高的病毒性疫病病。 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试验研究第九章临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析Europeanwildboar[J】．VetRes，2004，35(2)：243—253．[24】ChoiT，Glavits氏SzerediL，ela1．OccurrenceofpominedermatitisandnephropathysyndromeinHungary【J】．ActaVetHung,2002，50(1)：5—16．【25】刘道新，谈志祥，邱立新，等．规模化猪场猪瘟猪伪狂犬病猪圆环病毒2型感染的血清学调查【J】．中国兽医杂志，2004，40(7)：18～19 猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒在江西猪群的混合感染DetectionandAnalysisofCo--infectionsofPRRSV,csFv,PCV2andPRVinClinicalSpecimensSampledFromPigsinJiangxiABSTRACT：ToinvestgatetheCO·infectionscausedbyPRRSV,CSFV,PCV2，andPRV,twomultiplexPCR／RT-PCRweredeveloped．Assayone，amultiplexPCR,WaSfordetectingPRVandPCV2．TheprimersweredesignedbaSedonthesequenceofPRVgDandPCV2ORF2depositedinGenBank，andtheexpectedampliconswere217bpand403bp，respectively；aSsaytwo，amultiplexRT-PCR，WaSfordetectingPRRSVandCSFV．TheprimersweredesignedaccordingtothesequencesofPRRSVORF7andCSFVE2fromtheGenBank，andthepredictedPCRproductswere372ntand375nt，respectively．TheSpecificityandsensitivityofthismultiplexPCR／RT-PCRweredetermined．Atotalof253ClinicalspecimensfromdifferentpigfarmsinJiangxiweretestedbytwomultiplexPCR／RT-PCRmentionedaboveforthepresenceofPRRSV,CSFV,PCV2，andPRV．Theresultsshowedthat215werePRRSVpositive(85．O％)，143wereCSFVpositive(56．52％)，93werePCV2positive(36．76呦and6werePRVpositive(2．37％)，respectively．OnehundredthreespecimenswerepositiveforbothPRRSV／CSFV晰Ⅱ1aco—infectionrateof40．71％；fiftythreespecimenswerepositiveforbothPCV2／PRRSVwithaco-infectionrateof20．95％；twospecimenswerepositiveforPRRSV／PRVwithaco—infectionrateof0．79％；elevenspecimenswerepositiveforPCV2／CSFVwithaco—infectionrateof4．35％；onespecimenWaSpositiveforPCV2／PRVwithaco—infectionrateof0．40％；twentysixspecimenswerepositiveforPRRSV／CSFV／PCV2withaco—infectionrateof10．28％；onespecimenwaspositiveforPRRSV／PCV2／PRVwithaco—infectionrateof0．40％：andonespecimenwaspositiveforallfourpathogens(PRRSV／CSFV／PCV2／PRV)withaco．infectionrateof040％．KEYWORDS：Porcinecircovirustype2；Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；ClaSsicalswinefevervirus；Porcinepseudorabiesvirus；Co．infection100 全文总结1江西不同市县猪群疑似PCV2感染检测阳性率为74．34％，以PCV2b亚型为主，序列分析表明与浙江分离株(AY69l169)亲缘关系最近。2证实猪圆环病毒2型与猪戊型肝炎病毒存在混合感染，平均混合感染率10．62％(24／226)其中疑似病料混合感染率13．24％(18／136)，疑似血清混合感染率6．67％(6／90)。3江西猪群血清HEVIgG抗体阳性率，商品猪91．8％(349／380)，3～5月龄猪65．0％(13／20)，小于3月龄猪33．33％(10／30)：HEVRNA阳性率为18．45％，以基因4型为主。4来自江西不同市县猪群的临床病料，PRRSV、CSFV、PCV2和PRV四种病毒检测，单纯感染以PRRSV阳性率最高85．0％(215／253)，双重感染以PRRSV和CSFV阳性率最高40．71％(103／253)，三重感染以PRRSV、CSFV和PCV2阳性率最高10．28％(26／253)，也发现PRRSV、CSFV、PCV2和PRV四重感染现象(1／253)。101 致谢本论文是在导师陆承平教授悉心指导与关怀下完成的，恩师宽阔的胸襟，积极乐观的处世态度，渊博的学识，严谨专注的治学态度和忘我的工作精神深深影响着我。在我多年的学习、生活和科研工作中，倾注了恩师满腔的心血和精力，尤其是在科研道路上他给予我极大的鼓励和支持，令我终身难忘。值此论文完成之际，感谢恩师对我的谆谆教诲，教会我如何去做人和做学问，在此对恩师致以最诚挚的敬意。感谢南京农业大学动物医学院和研究生院的各位领导和老师对我的关心、支持和帮助。感谢江西农业大学的各级领导、老师和同仁对我的关心、支持和帮助。感谢我的家人，不但在生活上关心我，而且在学习工作上也给了我无限的支持。感谢所有关心和支持我的领导、老师、同学、同仁和朋友们，你们的关心、支持、鼓励和帮助让我终生难忘，并将继续激励我在今后的人生道路上更好地做事和做人。何后军二。一二年六月
