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1、实验一植物原生质体的分离和培养一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。三．难点：分离和培养原生质体的技术。四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。五．教学内容:实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是
2、一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素21/21酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性,使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯
3、(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。21/21从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶
4、降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。实验方法1．把叶片(或花期短的花瓣)洗净，把表面水吸干。（2人一组）2．撕去叶片背面的表皮，用2ml离心管的盖打下1圆片。圆片扣压于0.5ml酶液面上。让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层。0.5ml酶液已放入2ml离心管中。（酶液：4%纤维素酶，2%果胶覆酶，PH5.8，0.6mol/L甘露醇）。3．28~30℃保温酶解2~6h（放培养箱中）；镜检叶肉细胞原生质体。用血球计数板计数。4．600rpm离心5min，使原生质体沉降。吸除上面的酶
5、液。5．加0.2mol/L的加氯化钙液0.5ml，轻轻吹打均匀。6．用1mL注射器向离心管底部缓缓注入20%的蔗糖溶液1ml，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液.以600rpm离心10min，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体。7．用1mL21/21注射器取出管底的杂质、下部蔗糖溶液和上部氯化钙液。少许原生质体于载片上，盖片观察其形态，检测纯度。8．加MS培养液液1ml洗涤，轻轻混匀，600rpm离心5min，使原生质体沉降。吸除上面的溶液。9．加MS培养液液0.5ml,轻轻混匀,用血球计数板计数细胞密度,FDA染色测定原生质体的活性。10
6、．扣上盖子，在26℃下进行暗培养。观察细胞壁的再生和细胞分裂。实验结果结果讨论21/21六．课堂小结：根据学生的实验结果进行总结。细胞计数板的使用：细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer)计数板在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格。四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方
7、格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６=400小方格，也有的计数板为１６×２５=400格的，小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。21/21细胞计数先用试管稀释法制备禽类血细胞悬液：将禽类红细胞稀释液Ⅰ、Ⅱ分别置水浴锅中预热到４１～４２℃，取Ⅰ液１mL于试管中，用吸血管加入新鲜鸡血(或肝素抗凝血)２０霯，再加入Ⅱ21/21液１mL混匀，置该水浴锅中保温５０s左右，置室温，即为待检的血细胞悬液。可用于充液计数。取干洁的计数板，置于水平的显微镜载物台上，盖上盖玻片，使两侧各空出少
8、许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸
