植物原生质体分离、纯化与活力检测

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1、植物原生质体分离、纯化与活力检测刘亚靖200911020一.实验器材：普通生物显微镜、移液枪及枪头、恒温水浴箱、离心机、pH计、离心管、剪子、镊子、培养皿、烧杯、三角瓶、载玻片、盖玻片、镊子、血球计数板、酒精灯等。二.试剂：(1)CPW溶液：KH2PO427.2mg/L，KNO3101mg/L，CaCl2·2H2O1480mg/L，MgSO4·7H2O246mg/L，KI0.16mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，pH5.6。(2)预处理液：700mmol/L甘露醇(约13%甘露醇)，用CPW溶液配制。(3)酶解液：1%纤维素酶（cellulaseOnzukaR-1

2、0）、0.1%果胶酶（pectinase）、0.5%离析酶（MacerozymeR-10）用洗涤液配制。(4)洗涤液：含600mmol/L甘露醇(约11%甘露醇)的CPW溶液。(5)原生质体染色贮液：0.4%的台盼兰（用洗涤液配制）。三.实验材料：胡萝卜根皮层0.5-1.0mm。四.实验程序与操作要点1.原生质体的分离与纯化(1)取胡萝卜根去表皮和里心0.4293g，置薄层预处理溶液中，室温黑暗下预处理1h。(2)用吸管吸去预处理液，按材料：酶液=1：10的比例加入4.3mL酶解液，在26℃下保温黑暗酶解，其间不时轻轻摇动培养皿。(3)酶解2h后，取样在显微镜下观察到细胞壁的酶解

3、情况，每0.5h观察一次，有圆球形原生质体释放到溶液中时即停止酶解。实际情况为未能观察到圆球形原生质体而一直未停止酶解。2.原生质体的纯化由于纯化时的离心转速过大会导致原生质体破碎，故略过本步骤。而实际情况是原生质体已经破碎，离心后破碎的是细胞器。3.原生质体活力测定台盼兰活体染色法：吸取纯化的原生质体悬浮液1滴于载玻片上中，滴加染料混匀在明视野显微镜下观察，未被着色者为有活力的胡萝卜根皮层原生质体，深蓝色者是死细胞。实际情况为未染色者为有活力的细胞器，深蓝色者是死无活力的细胞器。4.原生质体密度测定：用血球计数板在普通生物显微镜下直接计数，根据单位体积的细胞数计算细胞密度。实际

4、情况为只观察到细胞器而未能进行细胞计数。五.实验结果本次实验结果并不理想，由于酶解时间过长，且酶液浓度处于试验阶段，错过了最佳的原生质体释放时间，导致后期观察到的均为细胞破碎之后内部的细胞器而并非分离出的原生质体。上图为10*40倍下仍很小的细胞器，而正确的实验结果应为10*4倍下仍很大的圆球形原生质体，且原生质体内应有红色的胡萝卜素。六.讨论与体会在参考的文献中胡萝卜根皮层原生质体的分离时间为36-48h，但是没有加入离析酶的，而本次实验加入了离析酶，大大加速了酶解时间，故应该及时进行镜检，观测原生质体的释放。镜检时直接使用40倍物镜寻找原生质体对烟草叶片适用，但不适合胡萝卜根

5、皮层的原生质体，放大倍数过大反而不易找到自身很大的原生质体。反应3小时后，可明显观察到胡萝卜根皮层已经碎裂成小块并变薄，这是酶解成功的现象，但仍未观察到原生质体，说明释放出的原生质体很可能已经破碎了。本次实验的体会是在参考文献时要注意文献和自身实验的条件变量，若不一致则需要考虑到条件改变导致的结果，而不应该直接套用文献中的结果来预计自身的反应结果。而尝试性试验中结果的检测都需要从最基本的做起，如酶解开始后每0.5h就观察一次，观察时从最低倍数开始观察，而不是跳过某些步骤，按照自身的预期去观察，否则预期错就可能导致正确结果的丢失而重新试验。最后是本次试验失败了，未能分离出原生质体，

6、纯化也未进行，染色只观察到细胞器有活力而未染色成功，平板计数均为细胞器，但成功找到了试验失败的根源，就可以重新设计试验，更正自身的错误，做出良好的结果，同时也警惕自己不再犯类似的错误，为以后的实验增加经验。七.思考题1.为了获得产量高、生活力强的原生质体，你认为在实验过程中应注意那些问题?原生质体大量释放后及时停止酶解，避免原生质体破裂。离心时转速要低，避免原生质体破裂。利用密度相同使原生质体悬浮在同一层，集中收集。原生质体要一直保持稳定的渗透压中，避免原生质体破裂。2.除了本实验介绍的方法，还可以用哪些方法判断分离的原生质体活力?荧光增白剂染色法，观察胞质环流法检测有活力的代谢

7、，随渗透改变的原生质体体积变化，用氧电极测放氧从而检测代表活力的呼吸代谢，光合作用研究等。3.原生质体培养方法有哪几种？各有什么优缺点？液体浅层培养(Liquidthinculture)　这是目前较常用的原生质体培养方法，一般适用于容易分裂的原生质体，将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口进行培养。这种方法操作简单，对原生质体损伤较小，且易于添加新鲜培养物。但这种方法也常使原生质体分布不均匀，发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育，尤其是难以定点观察单个原