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1、植物原生质体分离和活性鉴定实验目的1・学习植物细胞原生质体分禽纯化的方法。2•了解原生质体活性鉴定的原理。实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中，酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁,即可得到原生质体。由丁原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、
2、酶解时间及温度等因素对分离原牛:质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原牛质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光索。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。实验材料、用品材料：绿豆’烟草幼苗叶片等。绿豆烟草幼苗试剂：⑴酶解液(绿豆)：1%(W/V)纤维素酶1%(W/V)果胶酶Q7mol/L甘露醇;10mmol/LCaCI2.2H2O,0.7mmol/LKH2PO4,pH6.
3、8~7.0。(2)13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/LKH2P04,101.0mg/LKN03,1480.0mg/LCaCI2.2H20/246.0mg/LMgS04,0.16mg/LKI,0.025mg/LCuSO4.5H2O,13%(W/V)甘露醇,pH6.0。(3)酶解液(烟草)：用01%2-N-吗啡咻乙磺酸钠配制2%(W/V)纤维素酶』％(W/V)果胶酶,005mmol/L氯化钙Q6mol/L甘露醇,pH6.0o(4)洗涤液(烟草):0・2mol/L氯化钙,加有01%2-N-吗啡咻乙磺酸钠,pH6.0o(5)0.1%2・N■吗啡
4、咻乙磺酸钠或三轻甲基氨基甲烷溶液：内含20%蔗糖,pH6.0o⑹0.02%二乙基荧光＞(FDA):5mgFDA溶于lmlW酮中，避光4°C下贮存/吏用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中•使用时'使最终浓度为0.01%o(7)20%蔗糖溶液(8)无菌蒸镉水。仪器：摇床，离心机，倒置显微镜，普通显微镜，超净工作台，培养皿,离心管，载玻片，刀片，银子，过滤漏斗,200目筛网，吸管,高压蒸汽消毒锅，银子，解剖刀。实验步骤1.绿豆幼苗下胚轴:⑴绿豆种子用70%乙醇消毒启来水流水浸泡4h左右，于湿滤纸上萌发。25°C黑暗屮培养
5、约60h。取幼苗下胚轴或根为材料进行分离原生质体。(2)取黄化幼苗下胚轴2~3g,从弯钩下3mm处向下切取约5mm的切段，切成0.5mm的薄片置于10ml酶解液屮(也可以取1cm左右的绿豆幼苗的根尖作为实验材料，直接置于酶解液中)。置于摇床上,25〜28°C,60~70r/min,酶解6〜7h。⑶用200冃筛网过滤酶解液(制一张装片，观察)，滤液经lOOOrpm离心5min,弃去上清液。⑷用3~4mll3%CPW液洗涤并溶解沉淀,悬液经lOOOrpm离心5mirb留lml上清液'其余弃之。(5)取10ml离心管1支，注入3ml20%~25%蔗糖
6、，将沉淀的原生质体悬浮'用滴管吸出悬液小心地铺于蔗糖溶液上；1000rpm离心5—将位于中间一层的原生质体用吸管小心吸出至另一离心管中，沉淀制一张装片,观察。⑹用13%CPW液洗涤1〜2次，每次lOOOrpm离心5min,得到较为纯净的原生质体。用13%CPW液悬浮至一定密度并制一张装片，观察。(7)取1滴原生质体提取液在载玻片上，加入相同体积的0.02%FDA稀释液，静置2min后,于荧光显微镜下观察，发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。2•烟草幼苗叶片：⑴取充分展开的叶片，用自来水冲洗干净。(2)在超静工作台上川十
7、片用0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min(中间摇动儿次)。取出叶片，无菌蒸帼水漂洗5次。(3)将叶片放入大培养1111屮，吸去水分，叶背面朝上，用无菌铁子小心撕去下表皮，或用解剖刀将叶片切成0・5mm宽的小条。⑷另取1个培养皿或带盖的三角瓶，加入酶解液lOmL,放叶片约2爲浸泡。⑸在28C保温3~6h,屮间轻轻摇动2—3次。（6）用200目筛网过滤酶解液,滤液经600Xg离心5min,使原生质体沉淀下来。（刀用移液管吸去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在0.2mol/LCaCI2•2H202mL⑻用注射器（装上长针头）向离心管底部缓缓注入20%蔗糖
8、6mL,在600Xg离心5mino这时，在两相溶液的界面之间出现一层纯净的完整原牛质体，杂质和碎片都沉到管底。⑼取原生质体提取液1滴于载玻片上，加入相
