肿瘤坏死因子Ⅱ型受体在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖机制中作用的研究开题报告.ppt

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1、开题报告肿瘤坏死因子Ⅱ型受体在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖机制中作用的研究风湿免疫科张洪峰立题依据类风湿关节炎（RA）:滑膜炎关节破坏滑膜过度和恶性增生成纤维样滑膜细胞（FLS）TNF-αTNF-RTNF-RⅠmTNF-αTNF-RⅡcrosstalkingTRAF2,c-IAP1RA生物治疗InfilixmabEtanerceptFLS增殖NF-κBFas/FasLBcl-2研究目标在不同浓度TNF-α的刺激下，在不同培养时间点上，观察体外培养的RA患者FLS的增殖情况及观察TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl

2、-2的变化，包括形态、蛋白（Western-blotting）及mRNA（RT-PCR）变化。从而明确在什么浓度、在什么时间点上FLS增殖最显著、TNF-RⅡ表达最高。2.分别以TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及TNF-α的单克隆抗体封闭FLS表面的TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α（膜结合型TNF-α），再以TNF-α刺激封闭后的FLS，观察FLS增殖情况及观察TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的变化，包括形态、蛋白（Western-blotting）及mRNA（RT-PCR）变化；测定下游信号因子TRAF2

3、和c-IAP1的变化。探讨在TNF-α促FLS增殖作用中，TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α分别起什么作用。3.在TNF-α刺激前、后分别加入TNF-RⅡ拮抗剂（Etanercept）、TNF-α单克隆抗体（Infilixmab）及同时加入Etanercept和Infilixmab，观察体外培养的RA患者FLS的增殖情况，TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的表达变化，包括形态、蛋白（Westing-blot）及mRNA（RT-PCR）变化。探讨Etanercept和Infilixmab分别应用及合并应用时

4、对FLS的抑制作用。研究内容滑膜细胞培养在无菌条件下，取得新鲜的正常人（取外伤后关节修复或关节内游离体经关节镜切除）和RA患者滑膜组织（经关节镜切除），以胶原酶和胰蛋白酶联合消化人关节滑膜组织碎片，细胞悬液经200目筛网滤过，与CD14microbeads混合孵育后通过磁性ＭＡＣＳ分离柱收集抗CD68、CD14抗体阴性、抗Vimentin、Fibronectin阳性的非粘附细胞（Ｂ型细胞）进行培养。实验用3～7代细胞。实验一(1)取处于对数生长期的FLS，调整细胞浓度，TNF-α按1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10n

5、g/ml、20ng/ml及40ng/ml6个浓度梯度，接种于6孔细胞培养板，分别培养6h、12h、24h及48h。(2)在每一浓度梯度的不同时间点上，以免疫组化（HE染色）观察FLS形态；以流式细胞仪观察FLS表面TNF-RⅡ及Fas/FasL-Bcl-2的密度变化；以Westing-blot（免疫印迹）来检测TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的蛋白水平；以RT-PCR来测定TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的mRNA变化。实验二分别以抗TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及TNF-α的单克隆抗体封

6、闭FLS表面的TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α，再以TNF-α刺激封闭后的FLS，观察FLS增殖情况及观察TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的变化，包括形态（免疫组化、流式细胞仪）、蛋白（Western-blotting）及mRNA（RT-PCR）变化；测定下游信号因子TRAF2和c-IAP1的mRNA变化。分组方案A,抗TNF-RⅠB,抗TNF-RⅡC,抗TNF-αD,抗TNF-RⅠ、TNF-RⅡE,抗TNF-RⅠ、TNF-αF,抗TNF-RⅡ、TNF-αG,抗TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及TNF-α实

7、验三（1）在TNF-α刺激前分别加入TNF-RⅡ拮抗剂（Etanercept）、TNF-α单克隆抗体（Infilixmab），观察体外培养的RA患者FLS的增殖情况，TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的表达变化，包括形态（免疫组化、流式细胞仪）、蛋白（Westing-blot）及mRNA（RT-PCR）变化。（2）在TNF-α刺激后分别加入TNF-RⅡ拮抗剂（Etanercept）、TNF-α单克隆抗体（Infilixmab），观察体外培养的RA患者FLS的增殖情况，TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL

8、-Bcl-2的表达变化，包括形态（流式细胞仪、免疫组化）、蛋白（Westing-blot）及mRNA（RT-PCR）变化。（3）在TNF-α刺激前、后同时加入TNF-RⅡ拮抗剂（Etanercept）、TNF-α单克隆抗体（Infil