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1、生化技术实验指导书湖北工业大学生物工程学院二0—0年三月修订实验一酵母RNA的提取及其组分的鉴定一、实验目的1.了解稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的基本原理；2.掌握稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的具体操作方法。二、实验原理酵母中RNA的含量比较丰富（2.67%〜10%）,
2、（ijDNA的含量相对地较少（据资料报道，酵母DNA的含量低于RNA的20%）,因此从酵母中提取RNA比较方便。RNA溶于碱性溶液，碱性溶液使蛋白质带负电荷，促进RNA（带负电荷）与蛋白质的分离，碱性溶液可使酵母细胞壁变性，同时进行加热，可增加细胞壁的通透性，使核
3、酸从细胞内释放出来。因此，酵母粉用稀碱液加热抽提时，可将其中的RNA抽提出来。当碱性抽捉液屮和后，加入2倍体积的95%乙醇时，可以使抽捉物沉淀出来。抽提物的主耍成分是RNA的钠盐，并带有少量的蛋白质。用碱抽提时，RNA会有不同程度的降解。地衣酚（3,5•二軽基甲苯）是比较灵敏的测定戊糖的试剂，常用于测定RNA。核糖与地衣酚试剂反应呈现鲜绿色。地衣酚试剂反应灵敏，也易被其他物质干扰。DNA屮的脱氧核糖也可与地衣酚反应，因此，单靠地衣酚显色实验不能作为RNA与DNA鉴别依据。二苯胺试剂是常用于测定DNA中脱氧核糖的试剂，脱氧核糖与二苯胺试剂反
4、应产生蓝色物质，而RNA'P的核糖一般不与苯胺起反应。卩票吟碱可与硝酸银反应生成口色的卩票吟银化合物的沉淀。双缩服反应是检验蛋白质常用的颜色反应。双缩服或含冇两个以上肽键的化合物（蛋白质、肽等）在碱性条件卜•与硫酸铜反应生成紫红色的配合物。如果蛋白质含量很低时，此颜色反应不易观察到。三、试剂与器材(2)0.5%NaOH溶液;(4)10%硫酸溶液；(6)5%硝酸银溶液；1.试剂：(1)酵母粉(药用);(3)乙酸；(5)氨水；(7)95%乙醇;(8)地衣酚试剂(硫酸铁鞍l・35g,地衣酚2g,用蒸憎水配成50mL作为母液,保存于冰箱中。使用前
5、,取母液2.5mL,加浓盐酸41.5mL再加蒸憾水60mL)；(9)二苯胺试剂(1.5g二苯胺溶于100mL高纯度的冰醋酸屮，再加1.5mL浓硫酸);(10)10%氮氧化钠溶液;2.器材：(1)离心机(2)100mL离心管(3)100mL烧杯(4)试管(5)50mL量筒(6)水浴锅(7)电炉(8)台式天平四、实验操作1.提取(11)1%硫酸铜溶液。3000转/分以上4支1支5支1只1只1台1架取酵母粉4g,放入1OOrnL烧杯中，加0.5%氢氧化钠溶液30mL,将烧杯置沸水浴上加热半小时，并不时搅拌。加热完毕，加入乙酸约4〜5滴使溶液呈微
6、酸性（pH6）,然后倒入离心管中离心15分钟（3000转/分）。取上清液于100mL的烧杯屮，加入2倍体积的95%的乙醇，边加边搅拌，最后静置待其沉淀完全。进行过滤,滤渣先用15mL95%乙醇分2次洗涤。继用15mL无水乙醇分2次洗涤，洗涤时可用玻璃棒轻轻地把滤渣搅动，以免下层滤渣洗涤不到，待乙醇滤干后完成成分的鉴定。2.组成成分的鉴定（1）将上述提取到的沉淀物刮到100mL烧杯中后，溶于lOmLlO%的硫酸溶液屮，直接在电炉上加热，煮沸1〜2分钟进行水解；（2）取水解液0.5mL,加入地衣酚试剂ImL,直接加热，煮沸1分钟，观察颜色变化
7、；（3）取2mL水解液，加入氨水2mL及5%硝酸银ImL,摇匀后观察是否产生絮状的沉淀物（如不出现，放置lOmin再观察）；（4）取ImL水解液，加10%NaOH10滴，摇匀后再加1%硫酸铜溶液2滴，静置一会儿观察有无紫玫瑰色出现；（5）取ImL水解液加2mL二苯胺试剂，摇匀后，沸水浴屮加热10分钟，观察颜色变化；试从上述（2）〜（5）四个反应的情况，说明从酵母中提出的物质是不是RNA。%1.注意事项1.乙醇试剂易燃，应远离火源；2.用烧杯加热反应时，防止溶液外溅伤人；3.离心时一定要将离心管和内容物在天平上称平衡后再对称放入离心机中离心
8、，否则会损坏离心机并发生事故；4.过滤前滤纸用乙醇湿润，不能用水湿润，因为RNA溶于水；5.滤下来的乙醇应冋收使用。六、思考题1.木实验是根据RNA的哪些性质设计的？其设计思想如何？2.在提取RNA过程中所用试剂及加热的作用是什么？3.在进行组分鉴定前为什么RNA溶于10%的硫酸屮进行水解？4.稀碱法提取RNA为什么先不破壁？5.提取RNA冇哪些方法？如果提取具冇活性的RNA最好采用哪一种方法？还应注意些什么？6.提取DNA乂有哪些方法？如果提取具有活性的DNA最好采用哪种方法？7.试分析RNA水解液进行组分鉴定的现象并解释其现象产生的原
9、因。8.试分析本实验操作关键和注意事项，为什么？实验二地衣酚显色法测定RNA含量一、实验目的学习和掌握测定RNA含量的方法一地衣酚显色法的原理和操作方法。二、实验原理在三氯化铁及盐酸存在下，R
