第二章引起桑树细菌性枯萎病病原菌的分离和鉴定引言

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1、第二章引起桑树细菌性枯萎病病原菌的分离和鉴定引言从2001年开始，浙江省临安地区多处桑树种植园发生桑树枯萎，落叶症状等病害，由于桑农们缺乏正确病害的防患意识，毎年有20-30%的桑园发病，造成严重的损失。本研究室从2006年开始，多次到临安、桐庐等桑树种植园区调查桑病发生的情况，发现：桑树种植密集的园区，无论是嫁接苗还是实生苗在春伐期间，即4、5月份期间会出现零星的枯萎症状；夏伐后的7、8月份期间,加上高温高湿的气候，低洼积水的地块桑树萎蔦死亡严重，有明显的发病中心。从根部、木质部褐变的症状表现上分析与桑树青枯病和近，但是区别在于叶片症状多为发黄，变褐，烧枯后落叶

2、，而桑树青枯病的叶部症状为青枯凋萎，初期无发黄落叶现象。调查中发现病害能够感染现行的所有抗桑树青枯病的品种:湖桑39、白皮大种、真杜了桑、育2号，以及团头荷叶白、湖桑197等，农桑系列的产量和综合性状都比较高，但是据报道不抗青枯病，对当前病害也不具有抗性。基于症状和病害防治方面的难题，木研究室针对各地采集的样品进行集中处理，并对病因进行深入研究。比较了病原菌引起病害的特征、病原生理生化特性、脂肪酸类型和16SrDNA,⑺oB基因序列等特征，认为肠杆菌Enterobactercloacae是引起浙江省桑细菌性枯萎病的主要病原菌。肠杆菌是广泛存在的一类植物内生菌，在高

3、温高湿和空气不良的环境中会成为寄生作物主要的致病菌引起植物感病，Nishijima等人常在夏威夷岛发现E.cloacae的感病寄主，并通过验证发现该菌引起的番木瓜果内黄化病是由果蝇传播的(Nishijimaetal.2004)。国际上对肠杆菌的分类学地位，尤其是E.cloacae的种下分化特性一直存在争议，对该属菌株的正确鉴定也成了广泛关注的问题之—oStephan等人使用16SrDNA、卩基因序列,结合DNA-DNA杂交技术，分别于2007年和2008年分离鉴定了两株新的肠杆菌E.rturicensissp.nov.和E.pulverissp.nov.,他的研究

4、证明如果一株肠杆菌与所有的标准菌16SrDNA序列的和似性低于97.0%,rpoB基因序列和似性低于98.0%,则该菌有可能属于一个新的种(Stephanetal.2007;Stephanetal.2008)。1材料和方法1.1病害调查，样品采集及致病性鉴定1.1.1症状观察及其描述产生病害的植株包括成株，实生幼苗和嫁接苗。成株表现为整株枯萎，落叶，长势弱；幼苗早期症状表现为叶片焦枯，由边缘向内卷曲，似烧枯状，显症叶片很快凋落，症状自下向上表现。冇时症状只在发病的一侧表现，感病植株一侧的叶片症状表现比较严重，而另一侧则症状不明显。发病植株的根部变褐，切开后有菌脓溢

5、岀，茎部木质部也表现为褐变症状，同样在叶部表现萎鳶的一侧根茎部位的褐变相对严重。本研究室结合浙江省农业厅，杭州市农业局等工作人员通过现场调查取样分析，从症状上初步诊断为细菌性病害。1.1.2样品的采集及其病原菌的分离纯化和保存2006年6刀到11刀期间，本实验室从浙江临安，桐庐等地分批采取发病桑树样品30余份，分离细菌98份，具休分离方法如下：将不同部位的样品（根,茎）洗净，晾干，用剪刀剪成3mmx2cm大小，用0.1%/0.75%升汞/酒精浸泡1min后（时间根拯不同部位的材质适当缩短、延长），用灭菌水冲洗3次，晾干后剪碎，于200pL灭菌水屮浸泡，并用灭菌玻璃

6、棒捣碎组织，尽量使内部的病菌释放出来。15・20min后用接种环蘸取浸液，在铺有灭菌PT・M4培养基的平板上划菌，30°C培养24・48小时后，挑取单菌落，菌株经过三次划线纯化。挑取单菌落，接种于LB培养液中，30°C过夜摇菌。菌液加入20%甘油，分别在・20°C,・80°C保存，可以保存1-3年；另一份存于装有5mL灭菌蒸徭水的带塞子试管中,常温保存，可保存6个月，供平时试验使用。根据形态和致病能力，挑选9个分离菌作为代表性菌株进行鉴定，标准菌株阴沟肠杆菌溶解菌亚种E.cloacaesA）sp.dissolvensLMG2683和生癌肠杆菌E.cancero^

7、emisLMG26983由比利时根特大学国家菌种收藏中心提供，菌株具体信息见表2.1oTabic2」InformationofthemulberrywiltdiseasestrainsandEnterohacterspp.usedinthis菌株Strains寄主植物HostplantMIDISIaBIOLOGSIb基因数据库登录号GenBankassessionnumber16SrDNA■必BR2-2mulberry0.59R6-2mulberry0.64R11-2mulberry0.84R18-2mulberry0.73R3-3mulberry0.69R8-2

8、mulbe