肠道病原菌的分离与鉴定

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1、肠道病原菌的分离与鉴定一培养基的制备及常用培养基细菌的培养法EMB培养基的制备肠道病原菌的分离与鉴定（一）血清学检测-肥达氏反应培养基的制备(一)肉汤培养基材料：鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10％碳酸氢钠、试管、三角烧瓶、蒸馏水等。方法1．将新鲜牛肉500g切碎或搅碎，加水1000ml，放4℃冰箱或冷处浸泡过夜，然后煮沸30min，放凉，使残余的脂肪凝固，再用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为原量。2．1000ml肉水中加入蛋白胨10g、氯化钠5g，加热溶解。3．用精密pH试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。过碱时，可用10％醋酸校正之。4．分装于试管中或

2、三角烧瓶中，15磅(121℃)高压蒸气灭菌20～30min。高压蒸汽灭菌器(二)普通琼脂培养基材料：肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等。方法1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中，加热溶化。2．用pH试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。3．15磅高压蒸气灭菌20～30min。4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约15ml，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上，凝固后即成普通琼脂斜面培养基。(三)血液琼脂培养基有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良

3、，可用血液琼脂培养基进行培养。材料①普通琼脂培养基②血液(脱纤维羊血或兔血)方法1．加热溶化普通琼脂培养基。2．待冷至50℃左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀(注意勿使产生泡沫)。3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基。E.M.B琼脂培养基的制备成分蛋白胨10g磷酸氢二钾2g琼脂20g乳糖溶液(20％)50ml伊红溶液(2％)20ml美蓝溶液(0.5％)20ml蒸馏水1000ml制法①将蛋白胨和磷酸氢二钾加温溶化于蒸馏水中②校正pH值为7.6加入琼脂③煮沸溶化过滤后分装三角瓶中，每瓶定量分装④15磅30min高压灭菌⑤以无菌操作法按量加入经10磅20min高压

4、灭菌的乳糖、伊红美兰液，混匀后倾注平皿备用。E.M.B培养基原理大肠杆菌能分解乳糖产酸，使培养基pH值下降，伊红与美蓝相结合成一种复合物，酸性环境中，菌体带正电，易与伊红结合，故菌落呈紫黑色或紫红色，并有金属光泽。碱性环境中伊红与美蓝不结合，病原菌不分解乳糖，不产酸故菌落为无色半透明。其次，伊红、美蓝有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。用途用于分离肠道致病菌，是一种鉴别培养基。并有弱的选择作用。肥达氏反应肥达氏反应通常用已知的伤寒杆菌“O”、“H”菌液和甲、乙型副伤寒杆菌“H”菌液与病人血清作定量凝集试验(试管法)，以检测病人血清中有无相应抗体存在，根据抗体含量多少及增长情况用

5、于伤寒、副伤寒病的辅助诊断。材料①待检可疑伤寒病人血清(1:10稀释)②诊断菌液：伤寒杆菌“O”(O)伤寒杆菌“H”(OH)甲型副伤寒杆菌“H”(PA)乙型副伤寒杆菌“H”(PB)③生理盐水④吸管，小试管等。方法本实验四人一组，每人取6只小试管，排成一列，计四列为一完整试验。分别标明每列管号和诊断菌液如“O”、“OH”、“PA”、“PB”。按下表先向每管加生理盐水0.5ml，再加10倍稀释病人血清0.5ml于第l管，做顺序的等倍稀释，最后加入等量的诊断菌液，充分混匀，置37℃2~4h，再放室温24小时后观察结果。试管123456生理盐水（ml）0.50.50.50.50.

6、50.5病理血清10X（ml）0.5↘0.5↘0.5↘0.5↘0.5↘0.5→弃去诊断菌液（ml）0.50.50.50.50.50.5