高ACAC通过自噬诱导过量NETs引发机体免疫抑制的机制研究

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1、分类号．５单位代码：１０１８３：Ｓ８５６：研究生学号：２０１５８５２０３２密级公开＿吉林大学硕士学位论文学术学位（）高ＡＣＡＣ通过自噬诱导过量ＮＥＴｓ引发机体免疫抑制的机制研究Ｈ－ｎｄｕｃｅｄｉｇｈａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅｉｎｄｕｃｅｓｅｘｃｅｓｓｉｖｅＮＥＴｓｉａｕｔｏｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｕｔｏｈａｐｇｙ作者姓名：崔媛旭专业：临床兽医学研究方向：兽医内科学指导教师：刘国文教授培养单位：动物医学学院２０１８年６月高ACAC通过自噬诱导过量NETs引发机体免疫抑制的机制研究Highacetoacet

2、ateinducesexcessiveNETs-inducedautoimmunosuppressionbyautophagy作者姓名：崔媛旭专业名称：临床兽医学指导教师：刘国文教授学位类别：农学硕士答辩日期：2018年06月04日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、、修改、发行、出租改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则。，应承担侵权的法律责任吉林大学博士（或硕士）学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，

3、独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：名年４月叫日本研究由“国家自然科学基金项目”面上项目（31672621）资助ThisresearchwasfundedbygrantfromtheNaturalScienceFoundationofChina(31672621)中文摘要高ACAC通过自噬诱导过量NETs引发机体免疫抑制的机制研究围产期酮病奶牛会引发高酮血

4、症，血液中乙酰乙酸(acetoacetate,ACAC)、β-羟丁酸(β-Hydroxybutyrate,BHBA)浓度上升是高酮血症主要临床表现之一。患有酮病的围产期奶牛会出现能量负平衡、免疫力低下，同时会引发乳腺炎、子宫内膜炎等并发症。中性粒细胞作为机体的第一道防线发挥了重要的防御功能，当外源细菌侵入细胞时，中性粒细胞第一时间到达感染处，并通过多种方式进行免疫防御，传统认为中性粒细胞是通过吞噬病原微生物，形成吞噬泡的抗菌途径从而对细菌进行清除。近年发现，中性粒细胞消灭病原微生物除了传统上吞噬和脱颗粒两种方式，在2004年Brinkmann等人发现一种新的死亡方式，即中性粒细胞胞外诱捕

5、网(neutrophilextracellulartraps,NETs)。NETs是细胞非凋亡性死亡，是机体受到病原刺激后，从中性粒细胞中释放出来一种网状结构，将病原体包裹消灭，其网状结构主要成分是DNA。近期又有研究发现，NETs过量产生，不但不会起到防御作用，可能还会引发机体产生一些免疫疾病。自噬是生命体中普遍存在的一种自体消化途径，通过自噬途径可以维持生命体代谢平衡和保持细胞内环境稳态。自噬对NETs起到重要作用，抑制自噬会阻断细胞内染色质的生长。所以本试验目的是探究在mTOR通路下高浓度ACAC是否会引发自噬累积，及诱导NETs过量形成，同时自噬是否影响ACAC诱导NETs的生成

6、量。本试验首先通过模拟酮病病理浓度，检测在体外培养的中性粒细胞中，添加不同浓度ACAC(0mM,0.25mM,0.5mM,1mM,2mM)和高浓度ACAC(2mM)的不同时间(0h,1h,2h,4h,8h,12h)是否会引发中性粒细胞自噬累积。通过免疫荧光对自噬蛋白荧光强度进行定性分析，发现经高浓度ACAC诱导后LC3蛋白荧光强度明显高于空白对照组。同时又采用蛋白免疫印迹方法对LC3Ⅱ蛋白进行定量分析，结果和免疫荧光结果一致，高浓度的ACAC可以引发自噬累积。I其次，对高浓度ACAC作用下NETs形成情况进行研究。通过激光共聚焦显微镜可以清楚看到ACAC诱导中性粒细胞向胞外释放的DNA网

7、状结构。同时采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、佛波酯(phorbolester,PMA)作为实验的阳性对照。另外，还采用了蛋白免疫印迹、ELISA等实验方法对NETs上其他主要成分进行检测，结果显示，高浓度的ACAC可以诱导生成过量NETs。最后，对自噬是否影响高浓度ACAC诱导NETs形成的机制进行研究，分别添加自噬抑制剂3-MA,LY294002和mTOR通路激动剂MHY1485，通过蛋白免疫印迹、免疫