gpr50通过诱导自噬途径降解bace1分子机制的研究

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1、学校代码:10285学号:20134221139硕士学位论文（学术学位）GPR50通过诱导自噬途径降解BACE1分子机制的研究GPR50promotesdegradationofBACE1viainductionofautophagy研究生姓名姬雯莉指导教师姓名马全红专业名称神经生物学研究方向阿尔茨海默症的病理机制研究所在院部医学部神经科学研究所论文提交日期2016年5月万方数据GPR50通过诱导自噬途径降解BACE1分子机制的研究中文摘要中文摘要目的：研究G蛋白偶联受体家族（Gproteincoupledreceptor，GPCR）成员GPR50促进β-分泌酶（β-si

2、teAPPcleavingenzyme1，BACE1）降解的作用及机制，从而确定GPR50在阿尔茨海默病病理发展的作用，为治疗阿尔茨海默病寻找到新的药物靶点。方法：1）在HEK-293T细胞系上过表达BACE-HA，然后转染不同浓度的GPR50-FLAG，分析GPR50对BACE1蛋白的调控作用。2）在HEK-293T细胞系和MEF细胞系上分别加入自噬激活剂Trehalose和Rapamycin，作用不同的时间段，检测BACE1和LC3II蛋白水平的变化；在HEK-293T细胞系上使用自噬抑制剂3-MA作用不同时间段，检测BACE1蛋白水平的变化，分析BACE1是否经自噬

3、途径降解。3）在野生型MEF细胞和MEFATG5KO细胞上过表达GPR50，检测BACE1的蛋白水平变化；在CHO细胞上转染GPR50-FLAG，用自噬抑制剂3-MA处理细胞，转染48小时后利用蛋白印迹检测BACE1和FLAG的蛋白表达水平，分析GPR50是否经自噬降解BACE1。4）在HEK-293T细胞上过表达GPR50-FLAG或siRNA，利用蛋白印迹实验检测LC3-II的蛋白表达水平；在HEK-293T细胞上过表达GPR50-FLAG和LC3-GFP，使用免疫荧光染色技术对细胞进行染色，利用激光共聚焦显微镜观察GPR50对LC3形态变化的影响；从而分析GPR50

4、对自噬的激活作用。5）在HEK-293T细胞上过表达GPR50-FLAG，检测自噬相关蛋白LC3、ATG5、ATG7、CREB、mTOR等蛋白水平的变化；取三个月大的GPR50KO小鼠，提取脑组织蛋白，检测BACE1、ATG5、ATG7、CREB、LC3蛋白水平的变化，并且提取脑组织mRNA，通过q-PCR的检测方法来检测自噬相关基因ATG5、ATG7的mRNA表达水平；在HEK-293T细胞系上分别干扰GPR50和CREB，检测I万方数据中文摘要GPR50通过诱导自噬途径降解BACE1分子机制的研究BACE1、LC3的蛋白水平变化，分析GPR50激活自噬，调控BACE1

5、降解的分子机制。结论：1：蛋白印迹实验结果证明BACE1能够通过自噬途径降解；2：GPR50能够激活自噬以及自噬相关蛋白，并促进BACE1的降解；3：q-PCR结果显示GPR50对自噬相关基因ATG5、ATG7的mRNA水平有上调作用。总结：通过以上实验结果证明GPR50通过激活P-CREB从而激活自噬，并且促进BACE1通过自噬途径降解，从而可能为治疗阿尔茨海默病提供新的治疗靶点。关键词：GPR50，BACE1，自噬，阿尔茨海默病，CREB。作者：姬雯莉指导老师：马全红II万方数据GPR50promotesdegradationofBACE1viainductionof

6、autophagyAbstractGPR50promotesdegradationofBACE1viainductionofautophagyAbstractObjective:GPR50isamemberoftherhodopsin-likesubclassofGPCRs(Gproteincoupledreceptor).ToinvestigatethefunctionofGPR50inthepathogenesisofAlzheimer'sdisease,weexplorethefunctionofGPR50ondegradationofBACE1(β-siteAPP

7、cleavingenzyme1)andtheunderlyingmechanisms.Methods:1)AnalysisofthelevelsofBACE1byWesternBlottinginHEK-293TcellscotransfectedwithBACE-HAanddifferentamountofGPR50-FLAGplasmids.2)ToinvestigatewhetherBACE1isdegradedthroughtautophagybytreatingHEK-293TorMEFcellswithautoph